MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒基因复制的分子机制研究

摘要

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染可引起慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌严重危害人类健康，是医学界多年来致力攻关的一个难题。α-干扰素(Interferon alpha，IFN-α)是目前少数临床治疗乙型肝炎有效的药物之一，但对其抗病毒机制尚未完全明了。本室前期研究结果表明，IFN-α诱生的髓样细胞分化蛋白(MyD88)可发挥抗HBV复制的作用，可导致细胞总成分和胞浆中的HBVRNA水平显著下调，提示在转录后水平调控HBV的复制。 目前已知，MyD88蛋白是Toll样受体、白介素-1受体、白介素-18受体介导的信号通路中的关键分子，可通过信号级联最终引起核因子kappa B(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)依赖性信号通路的活化。 已有研究表明，部分细胞因子以及干扰素诱生的抗病毒蛋白可在转录后水平调控HBV的基因复制和表达，机理涉及对HBV RNA核外运输以及稳定性调节等环节，但尚不清楚IFN-α诱生的MyD88蛋白是否以同类机制在转录后水平抑制HBV的基因复制。本课题拟从细胞信号转导以及转录后水平调控两方面探讨MyD88蛋白抑制HBV复制的分子机制。 为探讨MyD88蛋白介导的NF-κB信号系统活化在抗HBV效应中的作用，首先构建了MyD88的截短突变体，然后与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞，研究它们对HBV复制的影响。 结果证实，MyD88全长蛋白、及其两个截短突变体M(1-151)、M(151-296)活化NF-κB的程度不同，并与抑制HBV蛋白以及复制中间体DNA合成的水平相一致，提示MyD88蛋白抑制HBV复制的效应与MyD88激活NF-κB信号通路相关。进一步以NF-κB的超抑制剂(super-repressor)IkBa-SR抑制NF-κB信号通路，研究NF-κB信号通路在MyD88拮抗HBV效应中的作用。 结果显示，与空载相比，单独转染MyD88和HBV的细胞中HBV core蛋白的合成显著降低；而当加入IκBα-SR共同瞬转后细胞中core蛋白的表达量显著增加。检测HBeAg和HBsAg以及HBV复制中间体DNA，得到相似结果，上述结果提示MyD88蛋白抑制HBV复制的效应依赖于NF-κB信号通路的活化。 进一步将HBV的复制型质粒与NF-κB信号通路激活剂-IKKα/IKKβ表达质粒共转染Huh7细胞，结果发现：IKKα/IKKβ在细胞内过表达后可显著降低细胞培养上清中HBeAg和HBsAg和复制中间体DNA的合成，并呈剂量依赖关系。 同时将HBV复制型质粒和IKKα/IKKβ、MyD88、IκBα-SR 分别或共同转染后检测HBV RNA的水平。结果发现，转染IKKα/IKKβ或MyD88均可抑制HBV在细胞内的转录；而IκBα-SR转染细胞中HBV RNA转录体水平则上调。以上结果提示，NF-κB信号通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV复制中发挥了关键作用。此外，为排除p38 MAPK或ERK1/2活化在MyD88蛋白抑制HBV复制中的作用，在MyD88与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞时加入SB20538或PD98059以抑制p38 MAPK或ERK1/2的活化。 结果发现，MyD88蛋白抑制HBV的效应在抑制剂处理组与非处理组间无显著差异，提示MyD88蛋白调控HBV复制不依赖p38和ERK1/2信号通路的活化。为进一步探讨MyD88蛋白在转录后水平调控HBV复制的机理。首先采用HBV启动子控制下的报告基因，检测MyD88蛋白对HBV启动子的活性的影响，结果发现MyD88蛋白对HBV启动子活性无显著影响，排除了MyD88蛋白通过调节乙肝病毒启动子活性抑制HBV转录激活的可能性。进一步在Huh7细胞中瞬时转染HBV复制型质粒和MyD88表达质粒，分离细胞核与细胞浆中的HBVRNA，用RNA slot和real-time PCR分析HBV RNA在两者中的分布。 结果显示，表达MyD88蛋白可同时下调细胞核与细胞浆中HBV mRNA的水平，但HBVRNA的核/浆比值增加了了2～3倍，提示MyD88蛋白有可能通过改变HBV RNA的核、浆分布比例从而影响HBV的基因复制。进一步利用转录后调节元件PRE(posttranscriptional regulate element)调控下的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道系统分析MyD88蛋白将HBV RNA滞留于细胞核内的可能机理。 结果发现，MyD88稳定表达细胞株中报道基因CAT的表达水平显著降低；在Huh7细胞中采用瞬时转染的方式也证明MyD88蛋白可特异性地抑制报道基因的表达，提示MyD88蛋白影响PRE序列介导的HBV mRNA的核外运输过程。另外，进一步对细胞转染MyD88后HBV RNA的半衰期检测发现，MyD88蛋白可降低HBVRNA的稳定性。 以上研究结果提示，MyD88蛋白可能通过影响PRE序列介导的HBV mRNA的核外运输过程、降低HBV RNA的稳定性来调控HBV的复制。 综上所述，在本室前期研究发现IFN-α诱生的髓样细胞分化蛋白(MyD88)可发挥抗HBV复制作用的基础上，本研究进一步证实NF-κB信号通路的活化在MyD88蛋白抑制HBV复制中发挥了关键作用，而MyD88蛋白可能通过影响PRE序列介导的HBV mRNA的核外运输过程、降低HBV RNA的稳定性来调控HBV的复制。以上发现丰富了对干扰素诱生的MyD88蛋白抑制HBV复制机理的认识。从多角度深入探讨MyD88蛋白调控HBV复制的分子机制，可有利于加深对细胞信号转导机制以及细胞基因功能等的认识，揭示病毒和宿主细胞相互作用的分子机理，并可为临床治疗及研制新型抗HBV药物提供理论依据和实验基础。

目录

声明

前言

第一章 MyD88蛋白抑制乙型肝炎病毒基因的复制与活化NT-κB信号通路的关系

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二章 MyD88蛋白与HBV RNA的核外运输和稳定性

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

论文总结及创新点

文献综述:NF-kB信号通路在病毒感染与抗病毒免疫中的作用

附录

致谢