RNA干扰Krüppel样转录因子8对肾癌786-0细胞体内外生长的影响

摘要

肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统的常见肿瘤,占全部成人肿瘤发病率的2％。根治性肾癌切除术(radicalnephrectomy,RN)是治疗局限性肾细胞癌最有效的方法,由于缺乏早期诊断及对晚期患者的有效治疗,此类患者仍保持着较高的死亡率。25%的肾细胞癌患者确诊时已处于局部进展期或发生转移。放、化疗对晚期肾细胞癌治疗效果不佳,5年生存率仅为5%-10%。白介素(interleukin)和干扰素(interferon)单一或联合免疫治疗由于毒性大,临床使用上受到限制,而且免疫治疗总缓解率不高。因此了解肾细胞癌转移和进展的分子机制对于提高早期诊断和患者生存率的治疗十分重要。Krüppel样转录因子8(Krüppel-likefactor8,KLF8)是Krüppel样转录因子家族成员之一。KLF8在恶性肿瘤中呈高表达,正常组织中低表达。相关研究表明KLF8通过激活细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的启动子,在粘着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)调控细胞周期、细胞致癌性转化、侵袭力、上皮间质转型(epithelialtomesenchymaltransition,EMT)方面发挥重要作用。但KLF8在肾细胞癌的发生、发展、侵袭方面所起的作用尚不清楚。本课题首先应用逆转录-聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和免疫组织化学方法检测42例散发性肾细胞癌患者的KLF8基因和蛋白质的表达情况,初步探讨了KLF8基因与肾细胞癌发生、发展的可能相关性。接下来将构建的经化学修饰的小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)转染到表达KLF8基因的肾癌786-0细胞中。明确KLF8-siRNA在基因和蛋白水平能够有效抑制KLF8的表达。并研究干扰KLF8基因后对细胞生长、细胞侵袭力、细胞凋亡和细胞周期,对FAK、cyclinD1、钙粘蛋白(E-cadherin)基因和蛋白表达的影响。然后接种肾癌786-0细胞形成裸鼠移植瘤模型后,探讨RNA干扰KLF8基因后对裸鼠致瘤性及肾移植瘤内KLF8基因和蛋白表达的影响。本课题采用RNA干扰方法研究KLF8基因对肾癌786-0细胞增殖和肿瘤生长的影响,为肾癌的基因治疗提供了一定的实验依据。第一部分KLF8在肾癌组织中的表达及临床意义目的:探讨Krüppel样转录因子8(KLF8)在肾透明细胞癌的表达及其临床意义。方法:应用RT-PCR和免疫组织化学方法从基因和蛋白水平检测了42例原发性散发肾透明细胞癌患者和癌旁正常肾组织中KLF8mRNA和蛋白的表达情况。结果:肾癌组织中的KLF8mRNA相对表达量为(0.869±0.049),癌旁正常肾组织的KLF8mRNA相对表达量为(0.416±0.018),组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。42例肾癌组织中有36例表达KLF8蛋白,表达率为85.7%(36/42);42例癌旁正常肾组织有16例表达KLF8蛋白,表达率为38.1%(16/42),肾癌组织KLF8蛋白表达水平显著高于癌旁正常肾组织,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。KLF8mRNA和蛋白表达与肿瘤大小(P<0.001)和临床分期(P<0.001)相关,与年龄、性别、细胞分化程度无关(P>0.05)。结论:肾癌组织KLF8mRNA和蛋白表达增高,可能与肾癌的发生、进展相关,有可能成为肾癌基因治疗的靶点。第二部分RNA干扰KLF8基因有效序列的构建和筛选目的:探讨RNA干扰KLF8基因有效序列的构建和筛选。方法:设计和合成可抑制KLF8表达的经过化学修饰的siRNA,并转染进入肾癌786-0细胞中。利用RTPCR和Westernblot方法检测KLF8mRNA和蛋白表达情况。筛选出一条抑制效率最高的KLF8-siRNA进入下一步研究。结果:与空白组(0.977±0.003)和阴性对照组(0.917±0.014)相比,各干扰组KLF8mRNA相对表达量分别siRNA1(0.276±0.017),siRNA2(0.084±0.005),siRNA3(0.316±0.014),组间差异有统计学意义(P<0.001)。与空白组(0.822±0.016)和阴性对照组(0.807±0.019)相比,各干扰组KLF8蛋白相对表达量分别siRNA1(0.491±0.012),siRNA2(0.264±0.029),siRNA3(0.401±0.013),组间差异有统计学意义(P<0.001)。空白组与阴性对照组KLF8mRNA和蛋白表达相比,组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与RT-PCR结果一致,siRNA2抑制KLF8蛋白效率最高。结论:构建成功的KLF8-siRNA序列可有效抑制肾癌7860细胞中的KLF8基因和蛋白表达,KLF8siRNA2序列抑制效率最高,选择它进入下一步研究。第三部分RNA干扰KLF8基因对肾癌786-0细胞体外生长的影响目的:探讨RNA干扰KLF8基因后对肾癌786-0细胞体外生长的影响。方法:将KLF8-siRNA2序列转染进入肾癌786-0细胞中。利用RT-PCR和Westernblot方法检测cyclinD1、FAK、E-cadherinmRNA和蛋白表达情况;MTT法检测肾癌细胞生长情况;MatrigelInvasionAssay方法检测肾癌细胞侵袭能力;流式细胞术检测肾癌细胞周期及细胞凋亡情况。结果:与空白组(0.693±0.008)、(0.487±0.020)和阴性对照组(0.715±0.010)、(0.490±0.021)相比,KLF8-siRNA2组cyclinD1mRNA(0.217±0.018)、FAKmRNA(0.113±0.012)表达均受到抑制(P<0.001);与空白组(0.780±0.017)、(0.810±0.021)和阴性对照组(0.607±0.024)、(0.593±0.008)相比,KLF8-siRNA2组cyclinD1蛋白(0.323±0.0611)、FAK蛋白(0.380±0.021)表达均受到抑制(P<0.001);而空白组与阴性对照组cyclinD1、FAKmRNA和蛋白表达相比,组间差异无统计学意义(P>0.05)。E-cadherinmRNA和蛋白表达上调。与空白组和阴性对照组相比,MTT显示KLF8-siRNA2组肾癌细胞生长减慢(P<0.05);MatrigelInvasionAssay法显示KLF8-siRNA2组细胞侵袭能力下降(P<0.001);流式细胞术分析表明与空白组和对照组相比,KLF8-siRNA2组G0/G1期细胞比例增加(P<0.001),S期比例减少(P<0.001),凋亡细胞比例增加(P<0.001)。结论:RNA干扰KLF8基因后可下调cyclinD1、FAKmRNA和蛋白表达,下调KLF8同时可上调E-cadherin的表达,同时减慢肾癌细胞的生长;降低细胞侵袭力;影响细胞周期及增加凋亡。KLF8在促进肾癌细胞生长、调控细胞周期,抑制细胞凋亡、维持细胞侵袭力等方面可能具有重要作用。KLF8可能是FAK调控肾细胞周期的关键因子,两者之间存在双向调节。RNA干扰下调KLF8基因有可能逆转肾细胞癌中EMT。第四部分RNA干扰KLF8基因对肾癌786-0细胞体内生长的影响目的:探讨干扰KLF8基因后对体内人肾癌细胞致瘤性的影响。方法:18只裸鼠随机分成空白组和阴性对照组、KLF8-siRNA2组,每组6只。采用肾癌786-0细胞悬液皮下接种3.5×10 6/0.2ml(RP1640和PBS液各为0.1ml)的方法制作裸鼠移植瘤模型。肾移植瘤成功后,分别给予等量PBS液、50μgscrambleRNA液及50μgKLF8-siRNA2液进行肿瘤注射治疗,3天1次,连续6周。于治疗6周后处死裸鼠,计算肿瘤瘤重及肿瘤体积及绘制生长曲线;并应用RT-PCR及Westernblot方法检测KLF8在mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果:治疗6周后KLF8-siRNA2组裸鼠肿瘤的肿瘤重量(2.073±0.067)g小于空白组(3.317±0.144)g和阴性对照组(3.333±0.185)g,组间差异有统计学意义(P<0.001),而空白组和阴性对照组组间差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组(0.488±0.021)和阴性对照组(0.483±0.017)相比,KLF8-siRNA2组KLF8mRNA(0.269±0.028)的表达显著降低,组间差异有统计学意义(P<0.001);与空白组(0.785±0.016)和阴性对照组(0.731±0.023)相比,KLF8-siRNA2组KLF8蛋白表达下降(0.278±0.044),组间差异有统计学意义(P<0.001)。而空白组和阴性对照组KLF8mRNA和蛋白相比,组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:转染KLF8-siRNA2后可有效抑制裸鼠模型肿瘤的生长并降低了瘤体内KLF8基因和蛋白的表达,提示KLF8基因在肾癌的发生、发展过程中可能发挥着重要的作用。本研究也为以KLF8为靶点的肿瘤基因沉默疗法提供了可靠的理论和实验基础。

目录

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 KLF8基因在肾癌组织中的表达及其临床意义

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 RNA干扰KLF8基因有效序列的构建和筛选

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 RNA干扰KLF8基因对肾癌786-0细胞体外生长的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第四部分 RNA干扰KLF8基因对肾癌786-0细胞体内生长的影响

材料与方法

结果

讨论

参考文献

研究总结

附录1 综述Kruppel样转录因子研究进展

附录2 RNA干扰技术在肾细胞癌研究中的应用

附录3 博士在读期间以第一作者发表文章情况

附录4 博士在读期间所获奖励

致谢