单个转录因子诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法

摘要

本发明涉及单个转录因子诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法，属于干细胞生物学及再生医学领域。体外合成转录因子NR5A1的化学修饰性mRNA，利用患者自体尿液中提取的外泌体作为递送载体，形成外泌体‑modNR5A1复合物，然后与患者自体组织来源的ADMSCs共培养，以诱导其分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞。通过本发明方法，不仅能够快速、高效的获取具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，同时该细胞能够对黄体生成素的刺激做出有效反应，而且具有成熟Leydig细胞雄激素合成相关的基因表达谱。利用本发明获取的Leydig细胞在男性性腺功能低下症的治疗方面，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于干细胞生物学及再生医学领域，涉及一种使人脂肪来源的间充质干细胞定向分化为具有睾酮分泌功能的睾丸间质样细胞的方法。

背景技术

睾丸间质（Leydig）细胞数量占整个睾丸细胞的3～5%，但其分泌的睾酮却占体内睾酮的90%以上。其结构受损或功能障碍是造成男性雄激素分泌不足的主因。临床上主要采用雄激素替代疗法，但长期补充雄激素会导致诸多并发症，如：精子发生异常、诱发心血管事件、增加罹患前列腺癌等风险。另外，单纯的药物疗法很难模拟体内正常雄激素水平的生理性变化。研究表明，通过移植具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，可以明显升高血清睾酮水平，且睾酮分泌呈现一定的节律性。显然，这种优势是雄激素药物所不具备的。

目前，获取Leydig样细胞的途径及方式均存在一定缺陷。传统的方法诱导干细胞分化，存在诱导时间长，诱导效率低下及伦理等问题；此外，采用病毒介导的转基因方式虽然快速、高效，但存在基因组整合致细胞癌变风险，无法应用于临床。为了解决这种窘况，迫切需要探索一种安全、快速、高效地获取Leydig样细胞的新策略。

在不同组织来源的间充质干细胞中，ADMSCs具有来源广，易获得性，可取自患者本人，能有效避免免疫排斥及伦理等问题，是一类最具应用潜力的间充质干细胞。近来，我们发现只需通过慢病毒过表达NR5A1基因（类固醇形成因子1基因），即可快速、高效实现人源ADMSCs分化为Leydig样细胞。由于其没有摆脱转基因的风险，同样无法应用临床。

研究表明，体外合成的化学修饰性mRNA（Chemically synthetic modified mRNA,modRNA）能在受体细胞内快速、高效表达目的因子，进而诱导细胞定向分化；如：神经细胞、血管内皮细胞及心肌细胞等，这充分表明modRNA同样具有传统转基因所具备的特性。重要的是，其不会带来转基因潜在的致突变等风险。如果能采用一种安全、高效的方式向自体ADMSCs导入特定的modRNA，诱导其定向分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，则解决了临床移植所面临的种子细胞缺乏，同时避免细胞移植带来的免疫排斥问题。这是临床转化前迫切解决的问题。但是，目前还没有一种同时具备“安全、快速、高效”地获取具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞的相关报道。

发明内容

为了解决现有干细胞诱导分化为Leydig样细胞的技术无法同时兼顾“安全、快速及高效”的问题，本发明提供一种新的体外诱导人源ADMSCs向Leydig样细胞分化的方法，通过体外合成转录因子NR5A1的modRNA（即modNR5A1），利用人尿源性外泌体（exosomes）作为递送分子的载体，诱导自体ADMSCs分化为Leydig样细胞，从而为男性性腺功能减退症（雄激素缺乏症）的临床治疗提供一种新的思路和方法。

本发明采用的具体方案如下：

本发明的目的一是提供一种诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞的方法，所述方法是在体外合成转录因子NR5A1的化学修饰性mRNA，即modNR5A1，利用患者自体尿液中提取的外泌体作为递送化学修饰性mRNA的天然载体，形成Exo-modNR5A1复合物，然后，将所述Exo-modNR5A1与患者自体组织来源的脂肪间充质干细胞共培养，诱导其分化为具有睾酮分泌功能的睾丸间质样细胞。

进一步地，所述方法的具体步骤如下：

a、从人的离体脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞ADMSCs，并传代培养；

b、体外合成modNR5A1：首先利用pTEMPlz质粒构建NR5A1的DNA模板，然后使用2×HiFi HotStart Ready Mix，通过Tail-PCR反应合成Poly T尾的线性DNA模板，检测浓度并调整为100-200 ng/μL；以核苷酸GTP、ATP、5mCTP及Pseudo-UTP为底物，通过HiScribe T7ARCA mRNA试剂盒介导的体外转录反应合成modNR5A1；

c、尿源性外泌体的提取：收集自体尿液，4℃条件下使用超速离心法分离外泌体；

d、尿源性外泌体加载modNR5A1：通过优化的超声处理，使步骤b合成的modNR5A1加载至步骤c所提取的外泌体，形成Exo-modNR5A1复合物；

e、将步骤d所述的Exo-modNR5A1复合物与步骤a所得的人源ADMSCs于37℃细胞培养箱共培养，诱导分化为具有睾酮分泌功能的睾丸间质样细胞。

其中，所述脂肪间充质干细胞提取于人源皮下脂肪组织或内脏周围脂肪组织。

所述的脂肪间充质干细胞和外泌体均来自于患者自体。

步骤d中所述优化的超声处理为：500V、3kHz 、5个循环，其中超声波每持续5秒、暂停2秒为1个循环。

本发明的目的二是提供一种核酸因子mod NR5A1，其能诱导脂肪间充质干细胞分化为睾丸间质样细胞，所述因子是通过体外转录合成的NR5A1基因的mod RNA。

本发明还的目的三是提供一种复合物，包含上述的mod NR5A1。进一步地，所述复合物为Exo-modNR5A1复合物，所述Exo-modNR5A1复合物是将所述mod NR5A1加载至尿源性外泌体形成。

本发明的目的四是提供上述核酸因子mod NR5A1或复合物在制备治疗男性性腺功能减退症药物方面的应用。

有益效果：本发明通过体外合成转录因子NR5A1的化学修饰性mRNA (modNR5A1），利用患者自体尿液中提取的外泌体（exosomes）作为递送modNR5A1的天然载体，形成外泌体-modNR5A1复合物（Exo-modNR5A1），然后，将Exo-modNR5A1与患者自体组织来源的ADMSCs共培养，以诱导其分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞。通过本发明方法，不仅能够快速、高效的获取具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，同时该细胞能够对黄体生成素（LH）的刺激做出有效反应，以分泌更多睾酮，而且具有成熟Leydig细胞雄激素合成相关的基因表达谱。利用本发明获取的Leydig细胞在男性性腺功能低下症的治疗方面，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是hADMSCs的形态学观察图；

图2 是尿源性外泌体的形态学观察（扫描电镜）及其鉴定（颗粒大小、分子标志物）；

图3 是红色荧光染料标记的外泌体加载modNR5A1后与hADMSCs共培养图；

图4 是本发明中hADMSCs分化为Leydig样细胞的形态学观察；

图5 是分化后的Leydig样细胞的睾酮分泌特点；

图6 是分化后的Leydig样细胞表达成熟Leydig细胞标志物的免疫荧光染色；

图7 是本发明方法的诱导分化效率(LHCGR、CYP11A1阳性细胞百分率)；

图8是分化后的Leydig样细胞表达成熟Leydig细胞标志物的Western blot检测。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1、人源ADMSCs的分离与培养。

手术室内收集包皮术后的切除组织，剔除皮肤保留下脂肪，无菌眼科剪剪碎，0.2%的胶原酶I溶液37℃条件下孵育1-2小时，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化、无菌过滤，250×g离心5分钟，弃上清，重悬管底沉淀后，再次离心，用含1%青链霉素、10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，接种至培养皿中，过夜培养后更换新鲜培养液，传代培养，留取第3代细胞（图1）冻存于-80℃备用。

实施例2、体外优化合成modNR5A1。

在避免核酸酶污染的情况下，首先利用pTEMPlz质粒（购自Promega公司，美国）和2×HiFi HotStart Ready Mix试剂盒（购自Kapa biosystems公司，美国），通过Tail-PCR反应合成Poly T尾的线性DNA模板（参考Kondrat et al., Methods in molecular biology,2017, 1521: 127-138）。即首先通过

以核苷酸GTP、ATP、5mCTP及Pseudo-UTP为底物，通过HiScribe T7 ARCA mRNA试剂盒（购自New England Biolabs公司，美国）介导的体外转录反应合成modNR5A1。即通过2XARCA/NTP Mix 10μl（浓度10 mM的GTP、ATP、5mCTP、Pseudo-UTP各2.5μl）、DNA模板1μg及T7RNA Polymerase Mix 2μl共20μl的混合反应体系，37°C条件下孵育30分钟后加入2 μlDNase I，37°C孵育15分钟以去除DNA即获得modNR5A1。

表1 本发明所述转录因子基因序列表信息。

表2 转录因子基因的克隆引物信息。

实施例3、提取尿源性exosomes，并使其加载modNR5A1分子。

收集包皮手术患者自体的尿液，于50ml无菌离心管中，4℃条件下使用超速离心法分离exosomes，首先2000×g离心20分钟剔除细胞及碎片，然后10000×g离心60分钟去除微囊，最后100000×g离心2小时；接下来，通过电子显微镜观察提取物的形态、大小（图2A），纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）检测提取物分子大小（图2B），Western blotting法检测exosomes标志物的表达情况（图2C），证实提取物为exosomes。

提取的 exosomes置于冰上，与荧光探针PKH26染料混合孵育12小时，使exosomes被PKH26标记。然后，通过优化的超声处理：500V、3kHz 、5个循环（超声波每持续5秒，暂停2秒为1个循环），使实施例2中合成的modNR5A1加载至exosomes，形成Exo-modRNA复合物。

实施例4、化学合成的modNR5A1分子诱导人源ADMSCs分化为Leydig样细胞。

将实施例3中所获取的Exo-modNR5A1复合物与实施例1中所获取的第3代人源ADMSCs于37℃细胞培养箱共培养12小时，荧光显微镜下即可观察到实施例3中标记exosomes的探针在细胞内发出红色荧光（图3），表明Exo-modNR5A1复合物进入人源ADMSCs内。共培养3天时，镜下观察到细胞形态发生显著变化，形态由长梭形变为椭圆形（图4），而对照组（Exo-Mock，即单纯外泌体组）的细胞形态未见明显变（图4）。 同时，采用化学发光法检测细胞培养上清液中的睾酮浓度（参考Huang et al., Journal of cellular andmolecular medicine, 2019,23(9): 6072-6084）。实验结果显示，诱导分化第3天时，Exo-modNR5A1基础组培养上清液中睾酮平均浓度为1.92 ng/ml，黄体生成素（LH）补充组的培养上清液中睾酮平均浓度则达5.8 ng/ml，诱导分化第5天时，Exo-modNR5A1基础组及其LH补充组的培养上清液中睾酮浓度均明显增加，尤其后者更是高达12.8 ng/ml，而对照组（Exo-Mock）的培养上清液中几乎检测不到睾酮存在（图5）；这表明Exo-modNR5A1诱导人源ADMSCs分化的细胞具有很强的睾酮合成能力，且能够对外源性LH激素的刺激做出有效反应，以分泌更多睾酮。

进一步，通过细胞免疫荧光染色、Western blotting检测诱导分化后的细胞是否表达成熟Leydig细胞的分子标志物，实验结果显示，与Exo-modNR5A1共培养后的人源ADMSCs细胞绝大多数表达3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-Hydroxysteroid Dehydrogenase,3β-HSD）、细胞色素P450 11A1（Cytochrome P450 Family 11 Subfamily A Member 1,CYP11A1）（阳性细胞百分率52.63%）及黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LuteinizingHormone/Choriogonadotropin Receptor，LHCGR）（阳性细胞百分率43.46%），而对照组的细胞（与Exo-Mock共培养）则未见表达（图6、图7和图8）。

综上所述，通过尿源性exosomes加载modNR5A1能够安全、快速、高效诱导自体ADMSCs分化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞，更重要的是，这些诱导分化后的细胞能够对LH激素作出有效反应，分泌更多睾酮，这为将来体内移植Leydig样细胞后，使其参与下丘脑-垂体-性腺轴的反馈调节奠定了坚实的基础。因此，本发明方法为男性性腺功能低下症（雄激素缺乏症）的临床治疗提供了一个崭新的策略，具有很强的临床转化前景。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。