Krüppel样因子8对肝癌细胞干细胞样特性影响的研究

摘要

目的:
　　肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)是在肝脏中最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率在全球癌症中位列第五，同时也是最常见的肿瘤致死原因之一。HCC的恶性程度极高，由于早期不具有明显的临床症状，许多HCC患者确诊时往往已处于晚期。现阶段，针对HCC的治疗已取得了较大的进展，可以选择的治疗方式也相对较多，手术仍然是首选的治疗方式。然而，由于外科手术的低切除率和高复发率，导致HCC的治疗效果并不十分理想，这迫使人们不得不深入研究其发生、发展、侵袭和转移过程中的分子机制，以期能进一步开发更有效的早期诊断和治疗手段。
　　近年来，随着对肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)研究的不断深入，越来越多的证据表明肿瘤的异质性与CSCs的分化密切相关。在肿瘤组织中，虽然CSCs所占比例很少，但已有的研究认为其不仅具有自我更新能力，还具备了多向分化以及无限增殖的潜力。此外，CSCs在肿瘤的多步骤转移、耐药以及复发过程中发挥了重要的作用。具有干细胞样特性的肝脏肿瘤细胞即为肝癌干细胞(Liver cancerstem cells，LCSCs)。深入研究LCSCs的调控机制并找到合适的干预靶点有望为HCC的治疗提供新的思路。
　　参与多种重要基因转录的Krüppel样转录因子8（Krüppel like factor8，KLF8）在HCC发生、增殖和侵袭等恶性生物学行为中起到重要的作用。在既往的研究中，我们首次发现Wnt/β-catenin途径是KLF8蛋白在HCC细胞中潜在的下游信号通路之一，Wnt/β-catenin在HCC细胞中的活性失调可能与KLF8蛋白高表达直接相关，因此KLF8蛋白表达水平异常可能与HCC癌变、侵袭和转移有着直接的联系。但到目前为止，KLF8在干细胞中的研究还很少，其对LCSCs的调控也尚未见报道。本次研究的目的在于探究KLF8成为新型LCSCs标志物的可能性，并阐明其在临床用药指征和联合化疗中的价值，为HCC的诊断和治疗提供新的思路。
　　方法:
　　1.临床资料及样本的收集:收集了80例于2008年3月至2011年10月在我院行手术治疗的HCC患者的临床资料及肿瘤组织样本。通过检测这些患者肿瘤组织中KLF8的表达水平并结合所记录的随访资料，分析KLF8的表达与患者预后的关系。
　　2.KLF8对HCC细胞系干细胞样特性的影响分析及机制研究:通过低粘附成球培养实验富集LCSCs，并通过qRT-PCR检测LCSCs中KLF8的表达情况;使用慢病毒干扰HCC细胞株中KLF8的表达，然后通过qRT-PCR、流式细胞实验、成球能力实验等多种方式来探究KLF8干扰后对HCC细胞系干细胞样特性的影响;并进一步探究KLF8与Wnt/β-catenin信号通路在HCC细胞干细胞样特性调控中的相互关系。
　　3.KLF8在肝癌细胞耐药中的影响分析:通过流式细胞实验、CCK8实验以及WB实验检测KLF8低表达HCC细胞系对临床常用药物索拉菲尼和顺珀作用的敏感性。
　　结果:
　　1.qRT-PCR检测80例HCC组织及对应癌旁组织中KLF8的mRNA表达水平，发现KLF8在76.3％(61/80) HCC组织中的表达量高于癌旁组织;通过WB检测22例HCC组织及对应癌旁组织，发现81.8％(18/22)的样本中，KLF8在肿瘤组织中的蛋白表达水平明显高于其癌旁组织;通过qRT-PCR分别检测了40例HCC患者的肿瘤组织、癌旁组织及门静脉癌栓(Portal vein tumor thrombus，PVTT)中KLF8的mRNA表达水平，发现KLF8在PVTT中的表达显著高于HCC及癌旁组织;通过对80例HCC患者的组织标本及其随访记录进行检测及统计分析，发现KLF8(+)患者的预后更差。
　　2.通过低粘附成球培养及qRT-PCR检测，发现KLF8在三种不同的HCC细胞系（SMMC-7721、MHCC-LM3、Hep G2）成球细胞中的mRNA表达水平明显高于贴壁细胞;从原代HCC细胞中分离出相应的成球细胞，发现KLF8在HCC患者原代成球细胞中的mRNA表达水平同样也高于原代贴壁细胞;通过qRT-PCR检测，发现KLF8在CD24(+)、CD90(+)和EpCAM(+)HCC细胞中的mRNA表达水平均明显高于CD24(-)、CD90（-）和EpCAM(-)的HCC细胞。
　　3.通过qRT-PCR检测，发现KLF8被干扰后，两种HCC细胞系（SMMC-7721和MHCC-LM3）的EpCAM、CD24、CD90、CD133的mRNA表达水平均显著下调;利用流式细胞仪对相应HCC细胞进行分析和分选后发现，KLF8被干扰后可降低LM3细胞株中EpCAM(+)细胞的比例;通过6孔板低粘附成球实验以及体外低粘附有限稀释实验，发现KLF8(-)HCC细胞系的成球能力被显著抑制，其成球的数量明显较对照细胞系少;通过qRT-PCR检测证实在KLF8干扰后，一系列HCC细胞的干性基因诸如Lin28、Bamil、Sox-2、OCT4、Nanog也显著下调。
　　4.通过qRT-PCR检测发现，KLF8在索拉菲尼和顺珀耐药的HCC细胞中的mRNA水平显著高于正常HCC细胞;通过流式检测发现相对于对照细胞系，KLF8(-)HCC细胞系在固定浓度的索拉菲尼（5μM）、顺珀(2μg/ml)作用下的凋亡细胞比例显著增加;通过CCK8实验发现，KLF8(-)HCC细胞相对于对照细胞系，其凋亡比例随着时间的推移而显著增加;PARP是常见的细胞凋亡标志。通过WB实验发现相对于正常细胞系，KLF8(-)HCC细胞系在一定浓度的索拉菲尼（10μM）或顺珀（2μg/ml）的作用下PARP的蛋白表达水平显著升高。
　　5.通过WB实验发现，β-catenin的蛋白表达水平在KLF8(-)HCC细胞系中显著下调;通过qRT-PCR检测发现，KLF8干扰后的HCC细胞中β-catenin下游分子C-myc，Cyclin D1，Survivin的mRNA水平显著下调;FH535是一种常用的Wnt/β-catenin信号传导抑制剂，添加FH535(40nM)后进行了流式细胞检测，发现添加FH535的实验组中KLF8（-）HCC细胞系中EpCAM(+)细胞比例与KLF8(+)HCC系中EpCAM(+)细胞比例基本持平;低粘附成球实验进一步证实FH535抵消了KLF8（-）HCC细胞系与对照细胞系之间成球能力的差异。
　　结论:
　　1.KLF8在HCC及远端转移组织中呈高表达，且KLF8高表达的HCC患者预后更差。
　　2.KLF8在LCSCs中高表达，且通过Wnt/β-catenin信号通路来促进了HCC细胞系的干细胞样特性。
　　3.KLF8促进了HCC细胞对索拉菲尼以及顺珀的耐药。

目录

声明

摘要

中英文缩略词对照表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

一、KLF8在HCC及远端转移组织中呈高表达，且KLF8高表达的HCC患者预后更差

二、KLF8在LCSCs中呈高表达

三、KLF8促进了HCC细胞系的干细胞样特性

四、KLF8影响了HCC细胞对索拉菲尼以及顺珀的耐药性

五、KLF8通过Wnt／β-catenin信号通路来促进HCC细胞的干细胞样特性

讨论

综述 肝癌干细胞的分子生物学研究新进展

参考文献

发表论文和科研工作情况说明

致谢