肺炎克雷伯临床菌株基因组岛的识别与鉴定

摘要

目前院内感染在临床感染病人中所占的比例日益增高，已经引起人们越来越多的重视。院内感染多由耐药的条件致病菌感染引起，抵抗力低下的病人如发生院内感染，将给治疗带来更大的困难。因此找到院内感染的传播机制，从而有效控制院内感染是临床治疗的一个重要方面。条件致病菌对医院抗生素压力环境适应能力的增强以及临床菌株中抗生素抗性基因的播散是导致院内感染传播的重要原因。先前已有大量研究发现，一些抗生素抗性基因正在临床条件致病菌中广泛播散。而一些特殊的基因元件可以在不同菌株之间水平转移，在这些元件中可以携带有抗生素抗性基因，这些基因元件的转移导致了抗性基因在菌株之间的传播。目前研究较多的可转移基因元件包括：接合性质粒、整合子、转座子等。这些基因元件中大多携带有各种抗生素抗性基因，它们可以通过不同的分子机制在不同的菌株之间进行转移，例如：接合性质粒通过接合作用，整合子通过att识别位点特异性重组，转座子通过两端携带的重复序列来达到重组的目的。这些基因元件的传播在一定程度上导致了临床耐药菌株的播散。
　　 另一方面，在临床条件致病菌株感染过程中，抵抗抗生素抗性压力只是其中的一个方面，除此之外，这些临床菌株还需要适应各种各样的生存环境压力，包括温度、pH、营养等等方面。而如何适应这些恶劣的环境，完成自身的生存，需要这些临床菌株能够快速的适应外界环境(包括抗生素抗性)多种方面的改变。近年来人们通过生物信息学分析发现在微生物的全基因组中，大部分的基因高度保守，称为“基因骨架”，另外一部分基因则变异性很大，称为“可变基因池”，而这部分“可变基因池”主要是由于基因的水平转移形成。近来有研究发现，一些大的基因片段可以在不同菌株之间水平移动，这些基因片段不同于接合性质粒、整合子或者转座子，它们自身具有一些典型的结构特点：常位于tRNA基因位点后面；常携带有编码整合酶或转座酶的基因；GC含量与基因组的保守骨架不同；携带有一些重复序列；基因片段大小不等，大的可达100 kb以上等。这些片段携带的基因也是多种多样的，可携带有与抗生素抗性相关的基因，也可携带有致病相关因子或者代谢相关基因等等。现在将具有以上特征的这些基因片段统称为“基因组岛(Genomic Island，GI)”。基因组岛的水平转移是形成“可变基因池”的主要来源之一，对于微生物在短时间内获得新特性快速适应环境从而实现在短时间内的进化具有重要意义。
　　 目前基因组岛已经在多种菌株中发现，研究较多的菌株包括Escherichiacoli、Salmonella enterica等。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是临床常见的条件致病菌之一，目前发现在肺炎克雷伯很多临床菌株可以产生β-内酰氨酶，有的还携带有超广谱β-内酰氨酶，导致对常用的β-内酰胺类抗生素耐药。目前在K.pneumoniae菌株中也发现一个来源于耶尔森菌属与致病相关的基因组岛。但是是否在K.pneumoniae临床菌株中存在着其它的基因组岛对于K.pneumoniae临床菌株的生存以及致病具有重要意义，目前还没有相关研究，因此本课题的目的是挖掘K.pneumoniae临床耐药菌株中的基因组岛，探讨K.pneumoniae临床耐药菌株播散的相关分子，为临床K.pneumoniae临床耐药菌株播散的检测以及控制提供一定的线索。
　　 由于基因组岛大小不等，变异较大，因此很难找到一个简单高效的筛选基因组岛的方法。有人曾采用基因芯片的方法对基因组岛进行筛选，但此方法费用较为昂贵，难以用于临床菌株基因组岛的普筛。由于基因组岛的一个典型特征就是位于tRNA基因位点后面，欧竑宇等人采用生物信息学方法对肺炎克雷伯菌株的tRNA基因位点进行分析，确定了一些可能为基因组岛插入热点的tRNA基因位点。同时进一步对这些位点的上下游保守序列进行分析，基于该位点上下游的保守序列设计特异性的引物对该位点进行筛选，根据PCR结果来确定是否有基因组岛插入。
　　 (1)K.pneumoniae临床耐药菌株中基因组岛的筛选针对生物信息学分析确定的基因组岛可能的插入热点进行PCR筛选，我们发现arg6 tRNA、asn34 tRNA、phe55 tRNA以及met56 tRNA这四个基因位点确实是基因组岛的插入热点。我们发现51株临床菌株在这四个位点上有83个位点上可能有基因组岛的插入，其中arg6tRNA基因位点16个，ash34 tRNA基因位点9个，met56tRNA基因位点7个，而phe55 tRNA基因位点则全部没有得到空位点长度的PCR产物。51株K.pneumoniae临床菌株phe55 tRNA位点处有44株临床菌株得到了3.7 kb的PCR扩增产物，我们将这个片段命名为KpGI-1，1株临床菌株(HS04160)得到了6.4 kb的PCR扩增产物，我们将这个片段命名为KpGI-2，6株临床菌株没有得到PCR扩增产物，怀疑有大的基因组岛插入。在K.pneumoniae MGH78578基因组中，在这个位点有一个12.6 kb的基因组岛插入，我们将它命名为KpGI-3。基因组岛KpGI-3中携带了1个整合酶基因和7个鞭毛编码相关基因。通过PCR筛选，我们发现菌株HS04053扩增得到了KpGI-3中7个鞭毛编码相关基因，但是没有整合酶基因，而是一个更长的基因片段取代了这个整合酶基因。因此我们可以判断在HS04053携带有一个变异了的KpGI-3基因组岛。
　　 (2)KpGI-1和KpGI-2确定为新的基因组岛我们将3.7 kb的PCR产物KpGI-1和6.4 kb的PCR产物KpGI-2进行测序，我们对KpGI-1和KpGI-2的基因序列分析发现，KpGI-1的GC含量为46.75％，KpGI-2的GC含量为38.03％，与K.pneumoniae MGH78578基因组57.5％的GC含量存在明显不同。同时KpGI-1和KpGI-2基因序列中，存在着163 bp的重复序列(DR)，这个163 bp的DR序列与K.pneumoniae MGH78578中的KpGI-3中的163 bp的DR序列完全一致。KpGI-1的orf2中携带有一个与转座酶一致的保守的结构域(pfam01527)，KpGI-2的orf1中携带有一个不完整的整合酶基因(CAD06800)。KpGI-1和KpGI-2的这些特点完全符合基因组岛的特征，因此可以将KpGI-1和KpGI-2定义为两个新的基因组岛。
　　 通过对新基因组岛KpGI-1和KpGI-2的DNA序列进行分析，KpGI-1中的orfs与目前已知的蛋白同源性均较低，但是有的基因中含有与已知基因一致的保守的结构域。KpGI-1中的orfs含有的结构域与乙酰基转移酶的结构域(pfam00583)一致，KpGI-1中的orf4含有一个未知的结构域。与KpGI-1相似，KpGI-2中的大部分orfs与目前已知的蛋白同源性均较低，KpGI-2中的orf4含有结构域DEXDc(DEAD-like helicases superfamily)(CDD accession no.cd00046)和HELICc(Helicase superfamily c-terminal domain)(pfam00271)。KpGI-2中的ORF5与Salmonella enterica Weltevreden HI_N05-537菌株中的Fic蛋白具有高度同源性，并且ORF5同时含有Fic(filamentation induced by cAMP，Fic)蛋白家族的结构域(pfam02661)。
　　 (3)基因组岛KpGI-2来源分析加基因最初在E.coil菌株中发现，被认为参与了cAMP诱导下细菌生长的调节。我们发现加基因不仅在E.coil菌属中高度保守，同时在K.pneumoniae菌属和S.enteria菌属中也高度保守。与E.coli菌属和S.enteria菌属不同的是，在临床菌株来源的已测序菌株K.pneumoniae MGH78578基因组中含有两个fic基因(kpn_03747和kpn_03553)。kpn_03747在K.pneumoniae菌属中高度保守且与E.coil菌属和S.enteria菌属中的fic基因具有高度相似性，而另一个fic基因kpn_03553则与保守的加基因kpn_03747相似性较低。
　　 在51株K.pneumoniae临床菌株中，所有的菌株都含有基因kpn_03747，且与邻近的基因也都具有高度的连锁性。而51株K.pneumoniae临床菌株中有3株失去了基因kpn_03553，其中一株为HS04160，失去了基因kpn_03553但携带有另一个fic基因，该加基因位于基因组岛KpGI-2中。同时我们进一步分析发现KpGI-2中的加基因与Salmonella Weltevreden HI_05-537中的fic基因Sew_A3907具有高度的相似性，而我们分析发现Sew_A3907也位于SalmonellaWeltevreden HI_N05-537菌株中phe tRNA.基因后的一个14.6kb的基因组岛上。由此我们推测HS04160中的基因组岛KpGI-2可能由S.enteria菌株中的基因Sew_A3907水平转移而来。
　　 (4)KpGI-2基因组岛的功能研究在E.coil K-12菌株中，cAMP可以诱导携带有fic基因的菌株发生丝化，并且使其生长也受到抑制，而fic基因突变株和cAMP受体(CRP)突变株在cAMP诱导后则没有细菌丝化现象以及生长抑制现象出现。因此，fic基因参与了cAMP对细菌丝化和生长的调节过程。我们将KpGI-2中携带的基因分别进行克隆，观察这些基因以及KpGI-2在cAMP作用下对细菌形态和生长的影响，我们发现这些基因在cAMP作用下对细菌丝化的诱导为非特异性的，但是对细菌生长却具有不同的作用。基因orf2+orf3在cAMP作用下明显抑制了细菌的生长，而orf4和orf5则与之相反，在cANP作用下明显促进了细胞的生长，而整个基因组岛KpGI-2在cAMP的作用下对细胞的生长的影响与含有空质粒的对照菌株相比没有明显差异。由于Fic蛋白被认为是毒素/抗毒素系统中Doc/PhD的前体，Doc蛋白有杀细胞作用，而PhD蛋白可以拮抗Doc蛋白的杀细胞作用，因此我们推测KpGI-2可能也是毒素/抗毒素系统的一种，携带的基因对细胞的生长具有相反的作用。