雌激素通过CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞介导抑制破骨细胞分化与骨吸收

摘要

骨骼系统和免疫系统共享许多调节分子,包括细胞因子及其受体、信号分子和转录因子。此外,骨细胞和免疫细胞处于共同的微环境骨髓腔中,免疫应答所产生和释放的各种细胞因子显著影响骨细胞功能和骨代谢。在生理和病理过程中,尤其是自身免疫性疾病和其他炎症性疾病中,与破骨细胞紧密关联的骨系统和免疫系统之间的联系更为密切。在2000年Arron和Choi将之命名为“骨免疫学”。
　　 破骨细胞在骨重建这个生理过程和一些疾病,如骨质疏松、类风湿性关节炎以及牙周病中发挥着重要的作用。破骨细胞来源于单核巨噬细胞系统的造血干细胞,并在巨噬细胞集落刺激因子(macrophagecolony-sthnuhtingfactor,M-CSF)和RANKL(receptoractivatorofnudearfactorkappaBligand,RANKL)的作用下,分化为多核的成熟破骨细胞(osteoclast,OC)。在风湿性疾病和炎症性肠病观察到激活的T细胞表达RANKL,进而OC形成增加;因此,免疫细胞调节着OC功能及骨吸收[1,2]。骨质疏松症被认为是一种慢性炎症性疾患[3]。
　　 第一部分调节性T细胞效应性细胞因子IL-10、TGF-β1对破骨细胞分化与骨吸收的抑制作用
　　 目的调节性T细胞主要通过分泌IL-10与TGF-β1发挥其免疫调节作用;本研究拟探讨调节性T细胞效应性细胞因子IL-10与TGF-β1对人胚骨髓细胞来源的破骨细胞分化与骨吸收功能的调控作用。方法人骨髓细胞取自孕13-16周药物流产胚胎,经M-CSF与RANKL体外诱导分化成OC细胞。靶细胞经不同浓度的IL-10与TGF-β1处理后,用TRAP染色观察破骨细胞分化;用甲苯胺兰染色骨吸收陷窝,以观察其骨吸收作用。结果经浓度为50ng/m的IL-10或TGF-β1处理后,能明显抑制破骨细胞分化与骨吸收作用;进一步研究发现,IL-10或TGF-β1对OC细胞的调控作用呈明显的剂量依赖性。IL-10与TGF-β1联合处理时,在10ng/ml时就显示出对破骨细胞分化与骨吸收作用的明显抑制,表明IL-10与TGF-β1对破骨细胞分化与骨吸收的抑制作用有显著的协同效应。结论调节性T细胞效应性细胞因子IL-10与TGF-β1对破骨细胞分化与骨吸收功能具有抑制作用;并且两者呈现协同效应。
　　 第二部分CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞对破骨细胞分化与骨吸收的抑制作用
　　 目的探讨CD4+CD25+调节性T细胞对人胚骨髓细胞来源的破骨细胞分化与骨吸收的调控作用及其调控机制。方法用免疫磁珠分选法从成人外周血PBMCs分离纯化CD4+CD25+调节性T细胞。以不同比例同骨髓细胞直接接触共培养与Transwell共培养,观察CD4+CD25+调节性T细胞对破骨细胞分化与骨吸收作用的影响,并用ELISA检测共培养上清IL-10与TGF-β1水平。在共培养系统中加入抗-IL10与抗-TGFβ1中和抗体,观察调节性T细胞对破骨细胞分化与骨吸收的调控,以解析其调控机制。结果Tregs与BMCs共培养时,Tregs抑制破骨细胞分化与骨吸收作用;Tregs与BMCs比例为1:50时仍具有抑制作用。比较Tregs与BMCs直接接触共培养与Transwell共培养,发现两组间差异无统计学意义(P＞0.05),表明Tregs主要通过分泌可溶性因子对OC的分化与功能发挥抑制作用。对共培养上清中IL-10与TGF-β1水平分析发现,共培养组IL-10与TGF-β1水平显著高于单独培养BMC组(P＜0.01),并且随着Tregs与BMC比例的增加,IL-10与TGF-β1的分泌水平增加;比较直接接触共培养与Transwell共培养,发现两者的分泌水平在两组间差异无统计学意义。当共培养系统中联合应用抗-IL10和抗-TGFβ1中和抗体后,能逆转Tregs对OC分化和骨吸收的抑制作用。结论CD4+CD25+调节性T细胞通过分泌细胞因子的方式抑制破骨细胞分化与骨吸收功能,其中IL-10与TGF-β1具有至关重要的作用。本研究对于理解骨稳态,及类风湿性关节炎、骨质疏松等疾病的发病机制及治疗新策略研究提供了科学依据。
　　 第三部分17β-雌二醇通过促进CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞分泌IL-10抑制破骨细胞分化与骨吸收
　　 目的探讨17β-E2对CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与骨髓细胞共培养时对破骨细胞分化与骨吸收的调控以及其作用机制。方法将Tregs/BMCs以2:50的比例直接接触共培养,同时设立未加入Tregs的BMCs组以及未加入BMCs的Tregs组,共3组。三组分别加入不同浓度的E2:10-7、10-8、10-9、10-10、mol/L,并且以相应浓度的溶媒为对照,分别加入有玻片和象牙片的24孔板培养7天和10天,进行TRAP染色和甲苯胺兰染色,并且收集培养48小时的上清,用ELISA检测IL-10与TGF-β1的水平。结果在BMCs组和Tregs/BMCs共培养组加入E2后发现,E2在10-7-10-9mol/L的浓度时对OC的分化和骨吸收呈现明显的抑制作用(P＜0.05);这种抑制作用与E2的浓度呈剂量依赖性,随着E2浓度的降低,这种抑制作用减弱;当E2在10-10mol/L的浓度时就失去了这种抑制作用(P＞0.05)。而共培养组OC的分化和骨吸收受抑制更显著。通过检测上清中IL-10与TGF-β1的水平,发现在Tregs组与Tregs-BMCs共培养两组中,IL10表达比BMCs组明显增高(P＜0.01),并且其水平与E2的浓度呈正相关;TGF-β1在Tregs组与Tregs-BMCs共培养中的表达明显高于BMCs组(P＜0.05),但不受E2浓度的影响。结论17β-雌二醇抑制OC的分化和骨吸收,并且在CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的作用下,这种抑制作用更为显著,这与E2通过增强Tregs分泌IL-10的作用密切相关。提示IL-10在OC-Tregs这个骨免疫网络中具有至关重要的作用,可以作为PMO治疗的靶点。