抗EGFPvIII单克隆抗体制备及其在肝癌治疗中的应用

摘要

抗体治疗是生物治疗的一个重要方面,也是肿瘤生物治疗的一个重要方向。其中抗表皮生长因子受体(EGFR)治疗性抗体药物已经在多种肿瘤治疗中应用。但是EGFR在多种正常细胞和组织中均有表达,使得EGFR抗体具有一定的局限性,而表皮生长因子受体3型突变体(EGFRvⅢ)仅在肿瘤中存在,因此相对于EGFR,EGFRvⅢ是一个更为理想的靶点。本研究旨在开发抗EGFRvⅢ的单克隆抗体以及验证其在肿瘤治疗中的有效性,为肿瘤治疗药物开发提供一个具有潜在价值的治疗性抗体。
　　 第一部分
　　 抗EGFRvⅢ单克隆抗体的制备及其特征分析
　　 [目的]寻求可以与表皮生长因子受体3型突变体(EGFRvⅢ)受体特异性结合的单克隆抗体。[方法]以EGFRvⅢ重组蛋白和NIH-3T3EGFRvⅢ稳定转染细胞系为抗原免疫BLAB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞系融合筛选得到特异性单克隆抗体细胞株。通过westernblot、免疫组化和体内荧光成像等方法鉴定抗体的特异性。利用SPR技术测定抗体亲和力常数,ELISA方法测定抗体亚型,通过抗原分段表达并ELISA方法鉴定抗体结合表位。[结果]通过杂交瘤融合技术,经过融合、筛选和克隆化,获得了多株杂交瘤细胞株。其中单克隆抗体12H123能和表达EGFRvⅢ的U87-EGFRvⅢ细胞结合,和过表达EGFR的A431细胞有较弱的结合,但是和野生型的U87细胞没有明显的结合能力。活体荧光成像分析表明12H23可以富集到U87-EGFRvⅢ种植瘤中。对抗体进一步分析显示12H23属于IgG1亚型,识别的序列包含在EGFR287-302aa(CC16多肽)内,该多肽的C端对抗体的结合更重要。另外该抗体具有较高的亲和力,其与抗原表位结合的解离常数Kd=1.73×10-10M。[结论]我们利用EGFRvⅢ重组蛋白和NIH-3T3稳转细胞系混合免疫的方法,成功获得了具有与EGFRvⅢ高效结合的单克隆抗体。
　　 第二部分
　　 EGFRvⅢ在肝癌中的存在与作用
　　 [目的]鉴定EGFRvⅢ在肝癌中的存在与作用。[方法]通过westernblot及RT-PCR等方法鉴定肝癌细胞系中EGFRvⅢ的表达情况,通过免疫沉淀、westernblot和RT-PCR方法鉴定肝癌组织中EGFRvⅢ的存在。利用稳定转染EGFR或EGFRvⅢ的Huh-7细胞系(分别称为Huh7-EGFR和Huh7-EGFRvⅢ),通过细胞迁移、MTT等实验测定EGFRvⅢ对肝癌细胞系的生长以及对5氟尿嘧啶(5-FU)耐药性的影响。通过体内的成瘤实验测定EGFRvⅢ对肝癌细胞系成瘤能力进行鉴定。[结果]多种肝癌细胞系和肝癌组织中有检测到EGFRvⅢ的存在。EGFRvⅢ阳性的细胞生长速度较快,并且对5-FU较不敏感。Huh7-EGFRvⅢ细胞表现出较快的体内外生长、较强的迁移及较高的5-FU抵抗能力。[结论]EGFRvⅢ在肝癌细胞和肝癌组织中存在,它能够促进肝癌细胞的成瘤,同时和肝癌的5-FU敏感性有关。
　　 第三部分
　　 12H23单抗对表达EGFRvⅢ的肝癌细胞系的作用及其与5-FU联合对肝癌作用及初步机理研究
　　 [目的]验证抗EGFRvⅢ单克隆抗体12H23单独作用或与5-FU联合对肝癌的治疗作用。[方法]通过体外的MTT细胞毒性实验和体内的Huh7-EGFRvⅢ种植肿瘤模型的治疗作用,来验证12H23抗体对细胞增殖的抑制作用和潜在的治疗价值。通过westernblot和荧光定量PCR等方法鉴定治疗前后相关基因的表达情况。[结果]12H23抗体在体外可抑制细胞增殖并促进5-FU的杀伤作用。体内治疗实验的结果显示25mg/kg的12H23抗体可以显著抑制细胞肿瘤的生长,抑制率到达59.8％。此外相对较低浓度(12.5mg/kg或5mg/kg)的12H23抗体和5-FU(25mg/kg)对Huh7-EGFRvⅢ种植瘤均有联合治疗作用。机理研究表明12H23可以通过降低DPD、TS和E2F-1的表达及提高OPRT表达来增强肝癌对5-FU的敏感性。[结论]12H23单抗具有对EGFRvⅢ表达阳性的肝癌的潜在治疗价值。12H23可望和5-FU联用增加对EGFRvⅢ阳性的肝癌的疗效。
　　 第四部分
　　 EGFRvⅢ人鼠嵌合单抗的制备及其初步特征分析
　　 [目的]重组表达EGFRvⅢ嵌合抗体并对抗体特性进行初步分析。[方法]通过RACE方法获得12H23抗体可变区基因序列,通过基因重组技术构建人鼠嵌合抗体的表达质粒,然后转染CHO细胞,筛选得到稳定表达抗体的细胞株,并通过ELISA免疫组合等方法,验证抗体的亲和力和特异性。[结果]成功获得了稳定高表达嵌合抗体的CHO细胞株,表达纯化的C12抗体经ELISA检测显示C12抗体和12H23识别同样的位点,具有类似的亲和力。免疫组化显示,C12抗体可以和EGFRvⅢ以及表达EGFR的Huh-7细胞结合,而与野生型的Huh-7细胞没有明显结合。[结论]我们成功构建了EGFRvⅢ的特异性嵌合抗体,并实现了在CHO细胞上的稳定高表达。而该嵌合抗体C12很好的保留了鼠源的12H23的亲和力和特异性,为后续进一步的临床前和临床实验提供了一个坚实的基础。