抗桔霉素单克隆抗体制备及其在红曲桔霉素检测中的应用

摘要

红曲，泛指红曲菌(Monascusspp.)在米饭或淀粉基质上生长发酵的产品。红曲在我国的应用至今已有一千多年的历史，是我国传统的特色发酵食品，主要生产地在福建、浙江、台湾等省，被广泛应用于食品发酵剂、食用色素、食品防腐剂、食品增香剂及中药的生产。然而自1995年，法国Blanc教授证实红曲中桔霉素的存在，使红曲的安全性受到质疑。目前桔霉素的检测方法主要是仪器检测方法，存在检测成本高、时间长和难于推广等缺点，因此，迫切需要建立一种经济、简便和快速的检测方法。 本文采用活性酯法将桔霉素与载体蛋白连接，获得了桔霉素的完全抗原，通过杂交瘤细胞技术，制备了抗桔霉素的单克隆抗体，建立了间接竞争ELISA，并分析了红曲中桔霉素含量。具体内容如下。 1、桔霉素人工抗原的构建 桔霉素(citrinin，CIT)分子量为250.3，属于只有反应原性而无免疫原性的半抗原(hapten)，必须与蛋白质等载体结合构建成完全抗原才能刺激动物产生抗体。根据桔霉素具备活泼羧基基团的结构特点，采用活性酯法分别与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)和卵清蛋白(ovalbumin，OVA)偶联制备得到免疫抗原CIT-BSA和包被抗原CIT-OVA，偶联比分别为8.4:1和6.3:1。并采用紫外和红外光谱法对偶联产物进行了分析。 2、抗桔霉素单克隆抗体的制备及其ELISA的建立 以CIT-BSA免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合率约为61.3％。采用有限稀释法，从阳性杂交瘤细胞株中筛选得到两株能稳定分泌高特异性、高灵敏度的抗CIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为5H1和787。 以上述制备的抗原和抗体为材料，通过对包被条件、抗原抗体反应条件等研究，优化得到了CIT的间接竞争ELISA条件为：CIT-OVA用0.05mol/mLpH9.6的碳酸盐缓冲液在4℃包被12h，包被浓度为2μg/mL，5H1和787所产腹水抗体用缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20的0.01mol/LpH7.4的磷酸缓冲溶液生理盐水，PBST)分别稀释为1:2000和1:1000，竞争抗原与抗体混匀37℃加入酶标板中反应1h，然后加入酶标二抗(以PBST作1:4000稀释)37℃反应1h，加底物37℃反应10min，用2mol/LH2SO4终止反应，测定OD492m值。 根据上述优化的ELISA条件，采用间接竞争ELISA，以竞争抗原CIT的浓度对数为横坐标，竞争抑制率为纵坐标，作图得到CIT对5H1和7B7抗体的竞争抑制曲线，CIT的检测灵敏度分别为24.95ng/mL和33.78ng/mL，线性方程分别y=-7.14x+72.97，(R2=0.962)，y=-7.83x+77.56，(R2=0.982)，线性范围均为2ng/mL～200ng/mL。 同时，在上述优化条件下，研究了5H1和787分泌的抗体对黄曲霉毒素(B1、B2、G1、G2、M1)和棒曲霉素(patulin)的特异性，结果表明，本研究所获得5H1及787分泌的抗体与以上毒素均无交叉反应。说明获得的两株细胞分泌抗体的特异性好。 3、红曲中的桔霉素加标回收及ELISA检测 在经HPLC确证不含CIT的空白红曲样品中，分别添加不同浓度CIT，添加量在0.05μg/g～0.5μg/g时，经间接竞争ELISA分析，CIT的平均添加回收率为83.2％～94.4％，变异系数为6.3％～9.6％。在此基础上，选取来源不同的28株红曲菌制得红曲米，经ELISA检测，样品中桔霉素含量在0.005μg/g～6.001μg/g之间，其中3份样品未检测出桔霉素。并通过HPLC和间接竞争ELISA同时检测其中12株红曲样品，结果表明两者没有明显差异。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1红曲菌

1.1红曲菌的生物学特征

1.2红曲菌的分类

1.3红曲菌代谢的产物

2红曲中的桔霉素

2.1桔霉素的理化性质

2.2桔霉素的毒性

2.3红曲菌中桔霉素的部分代谢途径

2.4桔霉素的检测

3研究目的和意义

第二章桔霉素完全抗原的构建与鉴定

1材料

1.1主要仪器

1.2主要试剂

2方法

2.1桔霉素与BSA的偶联

2.2桔霉素与OVA的偶联

2.3人工抗原的光谱分析

3结果与分析

3.1 CIT-BSA(OVA)制备

3.2人工抗原的红外光谱分析

3.3人工抗原的紫外-可见光谱及其摩尔比分析

4小结与讨论

4.1小结

4.2讨论

第三章抗桔霉素单克隆抗体的制备及性质分析

1材料

1.1主要仪器

1.2主要试剂和材料

1.3主要试剂与培养液的配制

2方法

2.1抗桔霉素单克隆抗体的制备

2.2抗桔霉素单克隆抗体的性质研究

3结果与分析

3.1抗桔霉素单克隆抗体的制备

3.2单克隆抗体的性质研究

4小结与讨论

4.1小结

4.2讨论

第四章红曲中桔霉素的间接竞争ELISA检测

1材料

1.1主要试剂

1.2主要仪器

1.3红曲菌种

2方法

2.1红曲米的制备及桔霉素的提取方法

2.2工作条件的选择

2.3标准曲线的建立

2.4添加回收率的测定

2.5间接竞争ELISA和HPIC测定红曲样品中桔霉素含量

3结果与分析

3.1标准曲线

3.2加标回收样品中桔霉素的检测

3.3间接竞争ELISA检测红曲样品中桔霉素

3.4 HPLC与ELISA测定结果的比较

4小结与讨论

第五章总结与讨论

1总结

1.1桔霉素人工抗原的合成

1.2抗桔霉素单克隆抗体的制备

1.3抗桔霉素单克隆抗体的性质研究

1.4间接竞争ELISA检测红曲中桔霉素

2讨论

2.1桔霉素人工抗原的合成

2.2桔霉素单克隆抗体的种类

2.3红曲中桔霉素的提取方法

参考文献

致谢

附录硕士在读期间发表文章