TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞IV型胶原表达过程中MAPK和Smad2通路之间的串话

摘要

前言：
　　肾小球硬化是肾小球肾炎和其他肾脏疾病发展过程中的一种常见病理改变,其主要病理特征是肾小球内细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)过度沉积。而肾脏系膜细胞(mesangial cell,MC)是目前公认的分泌肾小球ECM的主要细胞,在维持肾小球结构和功能完整性方面都发挥重要作用。Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen,collagen Ⅳ)是肾小球ECM的重要成分之一,特别是发生肾小球肾炎和肾小球硬化时,在MC能够影响到的系膜区和基底膜部位,Ⅳ型胶原的含量明显增多。因此,研究肾小球MC中Ⅳ型胶原的表达及其影响机制,对于认识和调控肾小球硬化具有重要意义。
　　MC可自分泌多种细胞因子,转化生长因子β1(Transforming growth factor β1,TGF-β1)就是其中的一种,TGF-β1是TGF-β超家族的成员,上调ECM基因表达、促进ECM沉积是其重要功能之一。因此,TGF-β1在肾小球硬化过程中发挥重要作用。TGF-β1主要靠其下游的信号传导通路来发挥作用,Smads家族是TGF-β1下游经典的信号传导分子。除此之外,还存在其他一些非Smad通路,如MAPK通路、AKT/PI3K通路等。MAPK信号通路是目前已证实的TGF-β1下游重要的非Smad信号通路之一,而且大量报道显示,TGF-β1/Smad和MAPK通路之间存在串话,其中以ERK1/2与Smad之间的关系研究最多,JNK、p38与Smad通路之间的关系研究相对较少。
　　饰胶蛋白聚糖(Decorin,DCN)是一种富含亮氨酸的小分子量蛋白聚糖,也是MC分泌的重要成分之一,主要分布在结缔组织中,属于ECM成分的一种。在调节细胞增殖分化、ECM合成沉积、细胞因子功能等方面发挥重要作用。DCN可以通过多种机制拮抗TGF-β1的生物学功能,因此,DCN是TGF-β1重要的抑制因子。我们实验室前期工作已证实,DCN可以抑制大鼠肾脏MC生长和基质合成,动物实验中,DCN可拮抗大鼠抗Thy-1.1肾炎模型病变肾小球的程度和发展。但其在肾小球病变中的作用机制目前还没有完全阐明。
　　在肾小球硬化中,TGF-β1主要作用于肾脏MC。研究表明,肾小球病变时TGF-β1在激活Smad信号通路过程中,也有MAPK通路信号分子被激活。但MC中MAPK-Smad信号分子之间的串话作用研究还是较少的。Hayashida等曾证明人的MC中,ERK1/2依赖的Smad3连接区磷酸化能够促进Ⅰ型胶原的表达,但ERK1/2和Smad通路之间相互影响的复杂机制还是没有完全了解。因此,本实验中我们在体外培养的大鼠MC中继续深入研究MAPK和Smad通路之间的串话作用,特别是除ERK12分子外,JNK及p38与Smad2之间的串话,以及这些串话在MCTGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达过程中的作用。同时,初步探讨DCN对Ⅳ型胶原表达的影响,及其对TGF-β1活化的MAPK和Smad通路的作用,为后续研究的展开做好铺垫。
　　第一部分TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞Ⅳ型胶原表达过程中MAPK对Smad2通路的影响
　　目的：探讨外源性TGF-β1对体外培养大鼠MC表达Ⅳ型胶原以及对MAPKs和Smad2信号通路的影响,同时观察该过程中MAPK对Smad2信号通路的影响。
　　方法：培养大鼠MC,在培养液中添加外源性TGF-β1,采用Western Blot方法观察MC内Ⅳ型胶原和MAPKs表达的变化;或者通过预先在培养液中分别添加MAPK信号通路抑制剂U0126、SB203580、SP600125,再用外源性TGF-β1因子刺激,采用Western Blot方法观察MC内Ⅳ型胶原以及MAPKs和Smad2表达的变化,同时采用Realtime RT-PCR检测不同处理后,Ⅳ型胶原mRNA水平的改变。
　　结果：用不同浓度的TGF-β1刺激MC6h,可见Ⅳ型胶原从1ng/ml开始有上升趋势,其中以2.5ng/ml升高最明显(P＜0.05)。然后以2.5ng/ml的TGF-β1,以不同的作用时间(0-6h)刺激MC,可见Ⅳ型胶原表达在TGF-β1作用后30min时即开始升高,6h升高最明显(P＜0.05),表明外源性TGF-β1诱导的MC内Ⅳ型胶原表达升高呈剂量和时间依赖性。与此同时,TGF-β1激活了MAPKs和Smad信号通路,TGF-β1作用15min后可见磷酸化的ERK、JNK、p38和Smad2均表达升高,其中磷酸化的ERK、p38和Smad2在TGF-β1作用后1h达高峰,磷酸化的JNK在2h达高峰(P＜0.05),然后逐渐下降。
　　使用ERK、JNK、p38通路抑制剂后,TGF-β1诱导的ERK、JNK和p38的磷酸化水平都有下降(P＜0.05)。同时,使用ERK、p38通路抑制剂后,TGF-β1诱导的P-Smad2C末端(P-Smad2C)和P-Smad2连接区(P-Smad2L)也下调(P＜0.05),但使用JNK通路抑制剂后,仅P-Smad2C下调(P＜0.05),对P-Smad2L无明显作用(P＞0.05)。
　　使用ERK、JNK、p38通路抑制剂后,再用外源性TGF-β1因子刺激,TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原蛋白和mRNA水平均下调(P＜0.05)。
　　小结：外源性TGF-β1诱导的MC内Ⅳ型胶原表达升高呈剂量和时间依赖性;TGF-β1活化的MAPKs和Smad信号通路,参与了TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达过程的调控。ERK1/2、p38和JNK通路与Smad2通路之间存在串话,但ERK1/2,p38与Smd2通路之间的串话和JNK与Smad2通路之间的串话又存在差异。
　　第二部分TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞Ⅳ型胶原表达过程中Smad2对MAPK通路的影响
　　目的：探讨Dominant Negative Smad2(DN-Smad2)质粒转染后对TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达的影响,同时探讨Smad2对MAPK通路的影响。
　　方法：培养MC,通过瞬时转染DN-Smad2质粒后,再用外源性TGF-β1因子刺激,采用Western Blot方法观察MC内Ⅳ型胶原以及MAPKs和Smad2表达的变化,同时采用Realtime RT-PCR检测不同处理后,Ⅳ型胶原mRNA水平的改变。
　　结果：DN-Smad2质粒转染后,再用外源性TGF-β1因子刺激,TGF-β1诱导的P-Smad2和Ⅳ型胶原表达水平下降(P＜0.05)。同时,在DN-Smad2质粒转染后,无外源性TGF-β1刺激的MC中基础状态和加TGF-β1诱导的P-ERK、P-JNK表达均下调(P＜0.05),但对P-p38的表达无明显影响(P＞0.05)。
　　小结：Smad信号通路本身参与了TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达过程的调控。同时,Smad2表达下调也能影响P-ERK、P-JNK的表达,推测Smad2还可能通过影响MAPK通路间接影响Ⅳ型胶原的表达。
　　第三部分饰胶蛋白聚糖对TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达及MAPK和Smad2通路的影响
　　目的：初步探讨饰胶蛋白聚糖(DCN)在Ⅳ型胶原表达过程中的作用及其对TGF-β1活化的MAPKs和Smad2信号通路的影响。
　　方法：培养MC,瞬时转染pcDNA3.1-DCN至MC内或用RNA干扰技术干扰MC内DCN基因表达,再用或不用外源性TGF-β1刺激,观察MC内Ⅳ型胶原表达以及MAPKs和Smad2通路的变化情况。
　　结果：DCN转染后,与正常对照相比,MC内DCN蛋白和mRNA水平升高(P＜0.05);同时,MC内Ⅳ型胶原蛋白和mRNA水平降低(P＜0.05);DCN转染后再用TGF-β1刺激,TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原表达降低(P＜0.05)。相反,DCN干扰后,与正常对照组相比,MC中DCN蛋白和mRNA水平下降(P＜0.05);而Ⅳ型胶原表达高于对照组(P＜0.05);DCN干扰后再用TGF-β1刺激,Ⅳ型胶原的表达高于单纯TGF-β1刺激组(P＜0.05)。
　　DCN转染后,再用TGF-β1刺激,TGF-β1诱导的P-ERK1/2、P-JNK、P-p38和P-Smad2的表达量均降低;DCN干扰后,再用TGF-β1刺激,与单纯TGF-β1刺激组比较,P-ERK1/2、P-JNK、P-p38和P-Smad2的表达量均无明显变化。
　　小结：成功将真核表达质粒pcDNA3.1.DCN和DCN siRNA转染至大鼠MC内。DCN过表达抑制由TGF-β1促进的Ⅳ型胶原的表达,而用siRNA干扰DCN表达后,TGF-β1诱导的MC中Ⅳ型胶原合成又升高,表明了DCN是影响TGF-β1诱导基质合成的重要因素。
　　DCN质粒转染后,可下调TGF-β1诱导的P-ERK1/2、P-JNK、P-p38MAPK和P-Smad2磷酸化水平,说明DCN表达上调可以拮抗TGF-β1对ERK、JNK、p38MAPK和Smad2的活化作用。DCNRNA干扰后,对P-ERK1/2、P-JNK、P-p38MPAK和P-Smad2磷酸化水平无明显影响,提示细胞生理性情况下的DCN对细胞内MAPKs和Smad2的活化无显著作用。
　　结论：
　　1.TGF-β1活化的Smad2信号通路和ERK1/2、p38、JNK信号通路均参与了TGF-β1对大鼠MC内Ⅳ型胶原表达的调控。
　　2.MAPK和Smad2通路存在交互串话,这种串话可能在TGF-β1诱导的MCⅣ型胶原的表达中起重要作用。
　　3.DCN下调TGF-β1诱导的Ⅳ型胶原的表达,是拮抗TGF-β1诱导基质合成的重要因素。DCN高表达时可以拮抗TGF-β1对ERK1/2、JNK、p38和Smad2的活化作用,但细胞本身生理量的DCN或表达下调在上述MAPKs和Smad2的活化中无显著作用。