Wnt信号通路及TCF7L2在2型糖尿病中的作用研究

摘要

第一部分2型糖尿病胰腺基因表达谱和Wnt信号通路基因表达的研究
　　目的:研究2型糖尿病(T2DM)病人胰腺组织基因表达谱变化;筛选出Wnt信号通路相关的差异表达基因;并验证转录因子7类似物2(TCF7L2)依赖的Wnt信号通路相关基因的表达水平。
　　方法:胰腺组织标本来源于复旦大学上海医学院病理科组织样本库。芯片样本为2例T2DM(平均年龄55岁)和1例非糖尿病(50岁),PCR样本包括4例T2DM(72±3.72岁)和5例非糖尿病(52±11.1岁)。捐赠者死亡后迅速获取胰腺组织,抽提总RNA。应用18,000个克隆的杂交膜进行cDNA微阵列杂交。芯片数据标准化处理后,采用倍数法筛选糖尿病和非糖尿病之间的差异表达基因,阈值为1.5倍。采用DAVID(http://dayid.abcc.neifcrf.gov/)在线分析工具,对差异表达基因进行日本京都基因和基因组百科全书代谢通路(KEGG pathvcay)功能富集分析。并用实时荧光定量PCR验证部分Wnt信号通路的基因表达,同时使用Western Blot检测核蛋白TCF7L2的水平。采用非参数Mann-Whiteney统计方法检验基因芯片结果与PCR结果的差异。
　　结果:基因芯片数据分析结果显示T2DM病人的胰腺差异表达基因有4200条;这些差异表达基因富集于Wnt信号通路、粘着斑、胰岛素信号通路、泛素化介导的蛋白降解通路,以及氧化磷酸化等40余条代谢通路;在Wnt信号通路中有41个差异表达基因,这些基因分布在Wnt信号通路的各个分支;定量PCR结果显示;与非糖尿病相比,T2DM胰腺Wnt4的mRNA相对表达量为1.691,Frizzled-4受体(FZD4)为1.158,糖原合酶激酶3β(＜3SK3β)为2.273,Ib异构体血小板活化因子乙酰水解酶的α亚基(PAFAHB1)为1.889,蛋白磷酸化酶2调节亚基2γ(PPP2R5C)为1.892,果蝇散乱基因(DVL1)为1.603,β连环蛋白(CTNNB1)为1.190,TCF7L2为1.929,这些数据与基因芯片表达水平相符;此外T2DM胰腺TCF7L2蛋白水平下调。
　　结论:
　　①T2DM胰岛β细胞功能受损可能与Wnt信号通路、粘着斑、胰岛素信号通路、泛素化介导的蛋白降解通路,以及氧化磷酸化等代谢通路有关;
　　②根据Wnt信号通路相关基因的芯片数据和PCR验证结果,推测T2DM时胰腺Wnt信号通路失调,可能处于受抑制或失活状态。TCF7L2是Wnt信号通路中的关键转录因子,TCF7L2表达水平的改变可能对其下游靶基因有重要影响,因此有待于进一步深入研究TCF7L2对全基因组转录的影响。
　　第二部分TCF7L2在小鼠胰岛β细胞全基因组结合位点的研究
　　目的:TCF7L2为经典Wnt信号通路的关键转录因子,近来研究证实TCF7L2与T2DM发病密切相关,本研究利用染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)薪技术研究TCF7L2在小鼠胰岛β细胞全基因组的结合位点,寻找TCF7L2的潜在靶基因。
　　方法:采用Western Blot检测小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞的TCF7L2蛋白表达水平,氯化锂干预培养的MIN6细胞24小时,利用染色质免疫共沉淀技术(Chip)获取TCF7L2蛋白结合的全基因组片段,利用基于solexa的新一代测序技术,在Illumina Genome Analyzer ⅡⅩ平台上对TCF7L2获得的片段产物和Input对照片段进行测序。利用eland算法将测序片段比对到小鼠的参考基因组(mm9);用macs软件包获取TCF7L2在全基因组上的侯选结合位点;利用meme软件包计算TCF7L2的基序(moilf);并利用课题组研制的软件包统计TCF7L2结合位点在全基因组上的分布;基于国家生物技术信息中心(NCBI)的基因表达数据库(GEO),分析TCF7L2与DNA结合对基因转录的影响;对启动子区有TCF7L2结合的基因利用DAVID在线工具进行功能富集分析。
　　结果:对TCF7L2和Input样品,利用ChlP-Seq技术,分别获得了2418万和3400万的原始序列簇(raw cluster),比对到mm9之后,分别获得了450万和1220万的特异比对片段(Unique Reads),测序错误率小于0.5％;通过生物信息学分析获得了17347个TCF7L2在全基因组上的结合位点;在这些结合位点中,有17.3％分布启动子区,有23.7％在内含子区,有2.1％在外显子区,有57.0％在基因问区;用meme软件包分析显示TCF7L2的基序为GAGA、TCTC重复序列;结合基因表达数据分析显示表达水平高的基因的转录起始位点(TSS)附近TCF7L2富集幅度低,而低表达基因富集幅度反而高;注释基因TSS±10kb内TCF7L2的候选靶基因有3600个,其中有15个明确是Wnt靶基因,有12个是已知的2型耱尿病易感基因;注释基因TSS±2kb内TCF7L2的候选靶基因有703个,KEGG代谢通路分析显示这些候选靶基因富集于丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPK)、Toll样受体信号通路、Janus激酶-信号转导转录激活因子(JAK-STAT)、胰岛素信号通路、细胞周期、凋亡等20余条通路,基西本体(GO)分析显示富集于细胞分化、减数分裂细麓周期、细胞成熟、细胞周期各阶段等生物过程。
　　结论:在MIN6细胞中,TCF7L2蛋白主要结合在基因间区,但对启动子和内含子有更高的结合倾向;TCF7L2对基因转录有抑制也有促进作用,但以抑制占优势。TCF7L2蛋白的全基因组结合位点包含明确的Wnt靶基因和已知的糖尿病易感基因,候选的TCF7L2靶基因主要参与细胞的生长、发育,及富集于MAPK、JAK-STAT、Toll样受体等与炎症相关的代谢通路。通过对小鼠咦岛β细胞TCF712蛋白候选靶基因的分析,推测TCF7L2可能通过已知的糖尿病易感基因、调控胰岛β细胞的增殖和凋亡、炎症相关基因等参与糖尿病的发生发展。为了证实TCF7L2真正的靶基因,尚需进一步研究TCF7L2在胰岛β细胞中对基因转录表达的影响。