鸭乙肝病毒感染鸭原代肝细胞差异蛋白质组的研究及DMSO维持鸭原代肝细胞易感性差异膜蛋白组的初步研究

摘要

乙型肝炎是严重危害人类健康的传染病，中国有近1.2亿人感染，其致病原乙肝病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科。HBV感染具有严格宿主、器官特异性，目前缺乏理想的HBV自然感染细胞和动物研究系统，对HBV病毒感染过程特别是早期感染过程机制仍然了解很少，与感染过程相关的细胞蛋白以及病毒感染对宿主细胞的蛋白表达及功能的影响同样缺乏研究。与HBV具有相似的病毒结构、基因组结构以及复制特点的鸭乙肝病毒(DHBV)，同属嗜肝DNA病毒；DHBV-鸭原代肝细胞(PDHs)模型能够获得很高感染效率，并可持续释放具感染性病毒颗粒，一直是研究嗜肝病毒的重要细胞和动物模型。
　　基于二维电泳(2-DE)和串联质谱联用(MS/MS)的蛋白组学方法在当今生命科学中得到广泛应用，既可以研究病毒颗粒上的宿主蛋白，又可研究病毒感染细胞感染前后的细胞差异蛋白组，同样可以研究病毒蛋白对细胞蛋白表达的影响，其高通量的数据为研究病毒与宿主相互作用及病毒感染机制打下基础。鸭是禽流感病毒及鸭乙肝病毒的重要宿主，但目前基因组数据缺乏；但鸡全基因组的测定和质谱技术特别是串联质谱技术的发展为鉴定鸭蛋白打下基础。全蛋白组可以整体研究蛋白组分变化情况；组分蛋白组(如亲水性蛋白和疏水性蛋白)可使2-DE能够分析一些低丰度的宿主蛋白。鸭原代细胞在5％的血清培养基里会逐渐丢失对DHBV的易感性，但含1.5％DMSO无血清培养基可维持其对DHBV的易感性，目前鸭原代肝细胞在不同培养基培养易感性改变机制未知。
　　本课题拟采用鸭乙肝病毒-鸭原代肝细胞(DHBV-PDHs)感染细胞模型，运用基于2-DE及MS/MS的方法研究：(1)DHBV感染鸭肝细胞后蛋白表达改变情况，研究DHBV病毒感染相关蛋白；(2)鸭原代肝细胞在5％血清培养基与在1.5％DMSO无血清培养基培养的差异组分蛋白组(亲水性蛋白组分和疏水性蛋白组分即膜蛋白)，研究可能与DHBV易感性相关的宿主蛋白。并利用生物信息学的方法对差异蛋白组的数据进行功能分类以及通路分析，分析差异蛋白在病毒感染过程中的作用。
　　DHBV感染鸭原代肝细胞的差异蛋白组显示，DHBV感染后24、72以及120小时的鸭原代肝细胞与未感染病毒鸭原代肝细胞的差异表达蛋白共有75个差异蛋白点(蛋白表达变化1.5倍以上)，其中质谱鉴定成功51个蛋白点，对应42个差异蛋白蛋白。差异蛋白主要涉及碳水化合物代谢、细胞骨架、氨基酸代谢、应激反应等；通路分析显示，在碳水化合物代谢差异蛋白中，GAPDH处于蛋白相互作用网络中心地位，HNF4alpha处于转录调节中心位置，在细胞骨架差异蛋白中，beta-actin以及vinculin处于蛋白相互作用网络中心位置。对差异蛋白功能分析显示，DHBV感染鸭原代肝细胞以后致细胞碳水化合物代谢和细胞骨架紊乱，可能利于病毒的复制和包装；使谷氨酰胺代谢增强，可能为病毒感染提供替代能量来源；病毒感染可导致细胞应激反应包括内质网应激和氧化应激反应；并对一些特定差异蛋白如Elongation Factor2在病毒感染过程中的作用进行了讨论。对差异蛋白annexin A2和beta-actin的差异表达情况同时进行了蛋白免疫印记验证。
　　为寻找影响DHBV的易感性的宿主蛋白特别是相关膜蛋白，利用2-DE分析了鸭原代肝细胞、在1.5％DMSO无血清培养基培养8天的鸭原代肝细胞、在5％FBS培养基里培养8天的鸭原代肝细胞的组分蛋白组(亲水性蛋白组分和疏水性蛋白组分即膜蛋白)。组分蛋白基于Trinton X-114对亲疏水性蛋白在温度变化的情况下溶解度不同原理。目前已完成2-DE预实验，为正式实验做好准备。
　　综上所述，本课题首次采用2-DE及串联质谱联用的方法分析了DHBV感染鸭原代肝细胞在感染后的差异蛋白质组，成功鉴定51个蛋白点、对应为42种蛋白质。差异蛋白功能分析显示，DHBV感染致肝细胞碳水化合物及细胞骨架紊乱，使氨基酸代谢增强，并引起细胞应激(内质网应激和氧化还原应激)，特定蛋白功能分析显示DHBV可能通过细胞Elongation Factor影响宿主蛋白的合成。DMSO影响鸭原代肝细胞对DHBV的膜蛋白组已完成预实验，证实膜蛋白组分析鸭原代肝细胞的可行性。本课题蛋白组学结果为研究DHBV及HBV与宿主细胞相互作用研究打下了一定的基础。