华东部分地区耐药结核病的分子流行病学研究

摘要

中国是仅次于印度的结核病负担大国。尽管从20世纪90年代开始，中国已经开始实施以直接面视下的短程督导化疗方案(Directly Observed Treatment，Short Course，DOTS)为策略的现代结核病控制项目，结核病发病率仅以每年1％的速度缓慢下降，2007年全国仍有各种类型的肺结核病患者约258万[1]。
　　中国是耐药结核病高发的几个国家之一。估计2006年中国新发耐多药结核病(Multidrug resistant TB，MDR-TB，指同时对异烟肼和利福平耐药的结核病)13万余人，占全球总数的25％，是全球MDR-TB发病数最多的国家[2]。随着氟喹诺酮类药物使用增加，广州的一个医院的研究发现临床上存在较高比例的氟喹诺酮类药物耐药结核病[3]。中国的结核病耐药问题尤其是氟喹诺酮耐药结核病问题，已成为中国公共卫生事业的新的挑战[4]。
　　监测数据显示，华东地区同样存在较严重的结核病耐药问题，有必要开展研究了解本地区耐药结核病的流行和传播状况以及相关的分子和社会学影响因素，为制定进一步的结核病控制政策提供依据[5-7]。因此，本研究以华东地区的莱阳县(山东省)、宁波市鄞州区(浙江省)和嘉定区(上海市)为研究现场，采用现场流行病学与现代分子生物学技术相结合的方法，从群体和分子水平上对该地区耐药结核病流行和传播进行了系统的研究。
　　研究的目的：描述研究地区一线抗结核药物耐药结核病和氟喹诺酮类药物氧氟沙星耐药结核病的流行状况，分析人群的社会人口学特征、临床特征、既往治疗史、人口流动等因素对耐药结核病流行的影响：分析基因突变与耐药表型之间的关系；探讨研究地区耐药结核病流行的潜在原因和机制，为当地控制耐药结核病的流行，阻断结核病的传播提供策略依据。
　　本研究具体研究方法和结果如下：
　　1.一线抗结核药物耐药结核病的流行及影响因素的研究
　　研究以2008年-2009年三个研究现场一年内登记的痰结核分枝杆菌培养阳性的结核病患者为研究对象，采用现况调查的方法结合比例法药物敏感性试验，描述当地结核病人对一线抗结核药物的耐药水平，研究共纳入306例合格的肺结核病患者，获得302例患者的一线药物药敏结果。患者的总耐药率为16.6％，总耐多药率为3.0％。其中，初始耐药率和初始耐多药率分别为16.7％和3.1％；获得性耐药率和获得性耐多药率为14.3％和0％。初始耐药结核病患者占耐药结核病患者的比例为96％。MTB对各种药物初始耐药率的顺位从高到低依次为：链霉素(11.8％)、异烟肼(8.0％)、利福平(4.2％)和乙胺丁醇(2.1％)。研究发现，初始耐药在研究地区耐药结核病的流行中占主要地位。
　　三个研究地区的结核病总耐药率分别为：莱阳：16.5％，鄞州：24.3％嘉定：8.8％。鄞州结核病的总耐药率高于嘉定(24.3％ vs 8.8％，OR=3.32，95％CI：1.45-7.58，P=0.004)；莱阳的结核病的耐药率也高于嘉定，差别没有统计学显著意义(16.5％vs 8.8％，OR=2.30，95％CI：0.80-6.63，p>0.05)。非本地患者的耐药率略高于本地人口(17.3％ vs 15.8％)，未发现统计学显著差异(X2=0.13，P=0.72)。另外未发现性别、年龄、既往治疗史等因素与上述对象发生结核病耐药有关。
　　采用直接测序法检测rpoB基因的利福平耐药决定区、kαtG和inhA基因的异烟肼耐药决定区、rpsL和rrs基因的链霉素耐药决定区的基因突变发现，90.9％(10/11)的利福平耐药MTB菌株在rpoB基因利福平耐药决定区发生基因突变；分别有52.2％(12/23)和21.7％(5/23)的异烟肼耐药菌株发生kαtG基因315位密码子和inhA基因第15位密码子突变，突变菌株数占异烟肼耐药菌株数的69.6％(一株菌株发生kαtG和inhA联合突变)：44.1％(15/34)的链霉素耐药菌株的rpsL基因的43位密码子发生突变，仅1株(2.9％)MTB菌株发生rrs基因突变，合并rpsL基因43位密码子突变发生。研究结果提示rpoB、kαtG、inhA、rpsL基因突变分别是当地利福平、异烟肼和链霉素耐药的主要机制。研究菌株中采片rpoB基因突变诊断MDR-TB的灵敏度和特异度分别为100％和99.2％，具有作为标志物诊断MDR-TB的价值。
　　2.氟喹诺酮耐药结核病发生率及其分布的横断面研究。本研究对成功传代的297株菌株进行氧氟沙星药物敏感性试验。研究共发现8株氧氟沙星耐药菌株(2.7％)，宿主均为初治患者，说明本研究地区的结核病患者对氧氟沙星的耐药水平相对较低，氟喹诺酮类药物对MDR-TB具有l临床治疗价值。60岁以上年龄组结核病患者发生氟喹诺酮耐药的比例为9.4％，高于60岁以下年龄组患者的耐药率(1.2％；OR：8.4，95％CI：1.9-36.2，P=0.006)，提示初治结核病患者中的老年病人是发生氟喹诺酮类药物耐药的高危人群。
　　对获取的293株菌株的DNA的gyrA基因的氟喹诺酮耐药决定区进行测序，37.5％(3/8)的氟喹诺酮耐药菌株发生gyrA基因耐药相关突变，提示gyrA基因突变是氟喹诺酮耐药MTB产生的重要机制。
　　3.MTB基因型成簇特征及影响因素分析。采用7位点MIRU-VNTR基因分型方法对成功获取DNA的293株MTB菌株进行基因分型，获取287株菌株的基因分型结果。鄞州、嘉定和莱阳分别有15株、10株和21株菌株形成7个、5个和9个基因型簇，成簇比例分别为：莱阳，24.1％；鄞州，14.9％；嘉定，10.1％。三个地区共46株菌株形成21个簇，簇中的菌株数为2～3株不等。成簇菌株所占比例较小，提示研究地区新发结核病例以既往感染复燃为主，近期传播所占比例较低。
　　比较成簇菌株的人口学特征发现，低年龄患者成簇比例高于高年龄患者(40岁以下vs 60岁以上：18.1％vs 10.0％，OR=3.15，95％CI：1.05-9.47，P=0.04；40岁-60岁vs 60岁以上：15.0％vs 10.0％，OR=2.11，95％CI：0.64-7.00，P>0.05)；居住在城区的患者感染的MTB的成簇比例高于居住在农村的患者(OR=2.29，95％CI：1.12-4.69，P=0.02)。低年龄人群和居住在城区的患者成簇的比例较高的原因可能是他们社会活动相对活跃，接触结核病人的机会高。耐药菌株的成簇比例(18.9％)与敏感菌株的成簇比例(15.2％)的差别没有统计学显著意义(耐药菌株/敏感菌株：OR：1.30，95％CI：0.60-2.89，P=0.51)，提示近期传播致病在药物全敏感和耐药结核病发生机制中的作用相当。研究也没有发现首发病例和继发病例在不同性别、年龄、涂片结果、治疗史和居住地等特征患者中分布的差别有统计学显著意义。没有发现本地患者和非本地患者感染的菌株成簇，提示本地患者和非本地患者结核病的传播相对独立，可能与两人群的工作和生活环境相对独立有关。在本研究21个基因型簇的46例患者中，共追踪到位13个簇(61.9％)中的20例(44.5％)患者，在2个簇(2/13，15.4％)中发现患者之间有明确的流行病学联系，提示偶然接触导致的疾病传播在研究地区MTB传播中占有较大比重。