一种利福平耐药结核病分子标志物、检测试剂及其应用

摘要

本发明提供了一种利福平耐药结核病分子标志物、检测试剂及其应用。涉及生物医学技术领域。所述分子标志物包括TRIM9、TRIM21和TRIM56基因及其表达产物；所述TRIM9、TRIM21和TRIM56基因在利福平耐药结核病患者中表达下调。本发明可以更快速、高效、敏感地鉴别利福平耐药结核病患者，可用于利福平耐药结核病的筛查。

说明书

技术领域

本发明涉及技术领域，尤其是涉及一种利福平耐药结核病分子标志物、检测试剂及其应用。

背景技术

结核病(tuberculosis，TB)是由结核杆菌感染引起的慢性传染病，是全球十大死因之一。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)估算，2019年全球新发结核病患者约996万，近几年基本维持在同一水平。2019年全球新发的结核病患者中，约有3.3％的新患者和18％的复治患者对利福平耐药。估算全球利福平耐药结核病(rifampicin-resistant tuberculosis，RR-TB)患者数约46.5万，其中耐多药结核病(multi-drugresistant tuberculosis,MDR-TB)约占78％。MDR/RR-TB患者的最新的治疗结局数据显示，全球MDR/RR-TB患者治疗成功率为57％。利福平耐药结核病是全球结核病控制的重要挑战，利福平耐药结核病患者的早期诊断以及合理治疗对于减少结核病传播至关重要。

目前，基于表型培养的方法仍然是药物敏感性测试的主要手段，但耗时较长，并且需要严格的微生物学安全预防措施。尽管Xpert MTB/RIF或线性探针等分子技术快速高效，但仍存在一定的假阳性率和假阴性率，且费用高，在基层单位尚未普及。因此，迫切需要开发出新的诊断标志物，建立快速、高效、敏感、经济的诊断方法。

宿主的天然免疫应答反应对结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的进展和控制至关重要。据报道，利福平耐药菌株和敏感菌株感染机体后可引发不同的免疫反应。因此，寻找具有调控天然免疫应答作用的调节因子，有利于该病的早期诊断和寻找新的治疗靶点。

基于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利福平耐药结核病分子标志物、检测试剂及其应用，本发明可以更快速、高效、敏感地鉴别利福平耐药结核病患者，可用于利福平耐药结核病的筛查。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种利福平耐药结核病分子标志物，所述分子标志物包括TRIM9、TRIM21和TRIM56基因及其表达产物；所述TRIM9、TRIM21和TRIM56基因在利福平耐药结核病患者中表达下调。

本发明从70多个不同成员的TRIM蛋白家族中，找到3个利福平耐药结核病的主要检测靶点：TRIM9、TRIM21和TRIM56基因。

在一个实施方案中，所述分子标志物指的是TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的mRNA或所表达的蛋白质。

前述利福平耐药结核病分子标志物在制备诊断和/或筛查利福平耐药结核病的试剂中的应用。

检测试剂在制备诊断和/或筛查利福平耐药结核病的产品中的应用，所述检测试剂用于检测TRIM9、TRIM21和TRIM56基因及其表达产物。

在一个实施方案中，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的产品。

在一个实施方案中，所述检测试剂能够定量检测样品中TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的表达量；

优选地，所述检测试剂包含PCR扩增引物、探针、基因芯片中的一种或多种；

更优选地，所述检测试剂包含用于扩增TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物。

在一个实施方案中，所述检测试剂所检测的是血液中TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的表达量，优选检测外周血单个核细胞中TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的表达量。

在一个实施方案中，用于扩增TRIM9基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

用于扩增TRIM21基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；以及

用于扩增TRIM56基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

TRIM9、TRIM21和TRIM56基因和/其表达产物的促进剂在制备治疗利福平耐药结核病的药物中的应用。

在一个实施方案中，所述促进剂包括促进TRIM9、TRIM21和TRIM56基因基因表达的试剂、促进TRIM9、TRIM21和TRIM56基因表达产物稳定性的试剂、促进TRIM9、TRIM21和TRIM56基因表达产物活性的试剂、促进TRIM9、TRIM21和TRIM56基因表达产物功能的试剂。

在一个实施方案中，促进TRIM9、TRIM21和TRIM56基因和/或其表达产物表达的试剂包括含有TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的试剂、携带TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、或含有TRIM9、TRIM21和TRIM56蛋白质的试剂。

一种利福平耐药结核病诊断试剂盒，所述试剂盒包括用于检测样品中TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的表达量的实时荧光定量PCR引物；其中，用于扩增TRIM9基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于扩增TRIM21基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；以及，用于扩增TRIM56基因的实时荧光定量PCR引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于扩增内参基因的引物对，所述内参基因为GAPDH；优选地，所述用于扩增所述内参基因的引物如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

在一个实施方案中，所述试剂盒还包括提取RNA的试剂和RNA反转录试剂。

在一个实施方案中，本发明通过以下方法进行利福平耐药结核病的筛查和诊断：

(1)裂解外周血红细胞，Trizol法提取总RNA，保存备用；

(2)优化实验条件，针对目标基因(TRIM家族基因，其中包括TRIM9、TRIM21和TRIM56基因)设计引物，采用RT-qPCR的方法检测两组人群(利福平耐药结核病患者和药物敏感结核病患者)的外周静脉血中TRIM9、TRIM21和TRIM56基因的表达水平；

(3)采用2

有益效果：

本发明首次将TRIM9、TRIM21和TRIM56基因及其表达产物作为利福平耐药结核病的诊断标志物，可区分利福平耐药结核病患者和药物敏感结核病患者；并提供了相应的检测试剂盒试剂盒，可以更好地实现利福平耐药结核病的诊断和筛查。

1.诊断效能高：本方法通过设计特异性引物，采用实时荧光定量PCR检测，并通过决策树模型对结果进行拟合，明显提高了对利福平耐药结核病的诊断效能；相比传统的检测手段，诊断灵敏度好、特异性强。

2.快速便捷：本发明的标本采用人体外周静脉血，标本容易获得。标本的前处理容易，实时荧光定量PCR耗时短，操作简便，较目前临床广泛应用的固体或液体培养加药物敏感试验明显缩短了检测时间。

3.生物安全性好：与培养加药敏法相比，本发明对标志物基因表达量的检测不需要严格的微生物学安全预防措施。

4.成本低：本发明较传统的培养法和目前上市的分子检测技术费用更低，降低了患者的治疗负担。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的药物敏感结核病患者和利福平耐药结核病患者外周血有核细胞中TRIM9基因的相对表达水平比较示意图；

图2为本发明实施例提供的药物敏感结核病患者和利福平耐药结核病患者外周血有核细胞中TRIM21基因的相对表达水平比较示意图；

图3为本发明实施例提供的药物敏感结核病患者和利福平耐药结核病患者外周血有核细胞中TRIM56基因的相对表达水平比较示意图；

图4为本发明实施例提供的TRIM9、TRIM21、TRIM56和组合物的ROC曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。

活动性肺结核患者是指具有结核病的临床症状，经痰抗酸杆菌涂片或培养阳性，病理证实或痰分子生物学证实的确诊结核病患者，包括了药物敏感结核病患者和利福平耐药结核病患者。

药物敏感结核病(DS-TB)是指肺结核患者的药物敏感试验提示对一线抗结核药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素)敏感。利福平耐药结核病(RR-TB)是指肺结核患者的药物敏感试验提示至少对利福平耐药。

以上人群均排除肿瘤、服用免疫调节药物治疗、HIV感染及其他自身免疫性疾病。

在本具体实施方式中，发明人将样本分为两组：药物敏感结核病组(DS-TB，32例)和利福平耐药结核病组(RR-TB，31例)。

实施例1.外周血有核细胞的制备

(1)早晨空腹采集每例受试者外周血2mL于含肝素钠抗凝的采血管中，在6h内制备有核细胞。

(2)1倍体积的新鲜全血，加入3倍体积的红细胞裂解液。在本实施例中，2ml新鲜全血加入6ml红细胞裂解液(solarbio，ID:R1010)，轻轻涡旋或颠倒混匀。

(3)冰上放置15分钟，其间轻轻涡旋混匀两次，红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。

(4)收集细胞：4℃，450×g离心10分钟以沉淀白细胞，小心吸弃上清液。

(5)向白细胞沉淀中加入两倍体积的红细胞裂解液(本实施例中加入4ml)，轻轻涡旋充分重悬白细胞。

(6)4℃，450×g离心10分钟沉淀白细胞，小心并彻底吸去上清液。

(7)加入1mL TRIZOL试剂(Invitrogen，ID：15596)裂解细胞，然后转移至离心管中，保存于-80℃，用于后续提取RNA。

实施例2.应用RT-qPCR方法检测TRIM基因的表达变化

1.RNA的抽提

(1)将实施例1中得到的细胞裂解液，在室温下融化，每管加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀20s，产生粉红色浑浊液无分层现象，室温静置10min。

(2)12000g/min，4℃离心15min，取出离心管，样品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。

(3)小心吸取无色上清水相移至新无RNA酶离心管，向得到的上清水相加入1/2TRIZOL体积(本实施500mL)的异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置20min。

(4)12000g/min，4℃离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％的乙醇(无RNA酶水配制)，轻轻摇晃离心管，洗涤RNA沉淀。

(5)7500g/min，4℃离心5min，小心吸尽上清，室温干燥RNA沉淀5min。

(6)加入20μL的无RNA酶水溶解RNA沉淀，并立即反转录成cDNA。

2.反转录

采用TRANS公司的

配制好的反应体系，在PCR仪上进行以下反应：42℃，15min；85℃，5s.反应完毕后，保存在-20℃。

3.实时荧光定量PCR

3.1引物序列

3.2实时荧光定量PCR检测目的基因

以上述步骤中得到的cDNA为模板，采用FOREVER STAR公司的试剂盒StarLighter

反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性20s，60℃退火34s，40cycle。

3.3数据处理及统计分析

根据实时荧光定量PCR的结果，用ABI7500 v2.3软件对结果进行分析，以GAPDH基因为内参基因，通过2

采用独立样本t检验分析方法，以P值＜0.05为差异具有统计学差异。应用GraphPad Prism 8软件绘制柱状图，结果参见图1-图3，其中横坐标表示不同受试人群，纵坐标表示相对表达量(2

结果表明，TRIM9、TRIM21和TRIM56基因在RR-TB患者中表达水平显著低于在DS-TB患者中的表达水平。在图1-图3中，DS-TB为药物敏感结核病患者，RR-TB为利福平耐药结核病患者，横线为平均值±标准误，*号代表P＜0.05。

实施例3.TRIM基因用于鉴别RR-TB和DS-TB的判定方法

根据上述的实验结果，可通过RT-qPCR鉴别RR-TB和DS-TB患者。本发明以TRIM9、TRIM21和TRIM56的相对表达量，使用SPSS 24.0软件通过ROC曲线分析各自及其组合的诊断效能。具体如下：

分别计算单个TRIM基因相对表达量鉴别利福平耐药结核病的ROC曲线，包括曲线下面积(AUC)、灵敏度及特异度，结果显示单个TRIM基因的AUC分别是0.808、0.704和0.526；敏感度分别是66.7％、71.4％和95.2％，特异度分别是87.8％、65.9％和19.5％。结果表明单个TRIM基因相对表达量鉴别诊断利福平结核病的效能均不理想。

采用Logistic逐步回归模型计算基因TRIM9、TRIM21、TRIM56组合物鉴别利福平耐药结核病的ROC曲线，通过数据计算和分析，构建组合物的二分类Logistic逐步模型的回归方程：

Logit(p)＝1.90-1077.96×(TRIM9相对表达量)-26.41×(TRIM21相对表达量)+41.54×(TRIM56相对表达量)

ROC曲线敏感度为83.3％，特异度为75.6％，AUC为0.828(95％CI＝0.734-0.921)(图4)具有较高的诊断效能。

以所述TRIM基因为模板设计特异性引物进行相对定量RT-qPCR检测，可用于利福平耐药结核病患者外周血的快速检测中，具有较高的诊断效能，操作相对简便，可以提高利福平耐药结核病的早期诊断率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京胸科医院；北京市结核病胸部肿瘤研究所

<120> 一种利福平耐药结核病分子标志物、检测试剂及其应用

<130> PA20047858

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<170> PatentIn version 3.3

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