重组截短型人角质细胞生长因子（rhKGF）的克隆、表达与活性初步检测

摘要

角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor)是成纤维细胞生长因子家族的一员，它通过与受体(KGFR)的结合，特异性地刺激上皮细胞的增殖，对皮肤、胃、肠、肾、膀胱、肺等上皮的损伤有修复作用，能减少放化疗所带来的副作用。而N端前23位氨基酸残基缺失后的截短型KGF(KGF<,des1-23>)具有更高的稳定性和活性。 为了制备高纯度和高活性的人截短型KGF，本研究采用基因重组技术，选择单一、融合和分泌三种表达方式构建了多个不同的原核表达菌株，并构建了巴斯德毕赤酵母胞外和胞内表达两种菌株，分析了不同菌株的表达情况。本研究还摸索了表达菌株的发酵工艺、探索了不同形式表达产物(包涵体、可溶蛋白和融合蛋白)的纯化工艺。本研究还通过蛋白N端测序和免疫印迹对目标蛋白进行了鉴定。最后，采用上皮细胞和间质细胞进行了促细胞增殖活性的检测。 最终，本研究得到了两个原核表达菌株，初步建立了纯化工艺并获得少量的目标产物;蛋白N端测序和免疫印迹验证结果表明，表达产物与理论设计的人KGF<,des1-23>相符；细胞实验显示，本研究获得的表达产物对上皮细胞有明显的促增殖活性。 另外，本研究对KGF<,des1-23>蛋白的突变体进行了同源模建，通过分析其突变前后的原子位移均方根偏差构象变化，找出可能的重要位点，并通过基因重组的方法进行了初步的分析验证。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

引言

第一部分rhKGFdes1-23表达工程菌株构建与鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分rhKGFdes1-23新型可溶表达工程菌株的构建和表达

材料与方法

结果

讨论

第三部分重组工程菌表达产物纯化分析与活性检测

材料与方法

结果

讨论

第四部分KGFdes1-23活性重要位点的初步分析

材料与方法

结果

讨论

结论与展望

参考文献

致谢

综述一角质细胞生长因子及其对消化道损伤的防治作用

综述二重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达