脑动静脉畸形Notch信号通路的差异表达及NCEx在脑出血鼠与缺氧HBVEC的表达研究

摘要

第一部分Notch信号通路基因在人脑动静脉畸形和周围脑组织中的差异表达
　　目的:应用基因芯片研究人脑动静脉畸形(brain arteriovenousmal format ions，BAVM)畸形团及周围脑组织的Notch信号通路相关基因的差异表达。
　　方法:收集有出血史的5例脑动静脉畸形，在畸形团、周围脑组织分别取材，进行Notch信号通路基因芯片杂交，得到基因芯片上各基因点数值型信号强度，计算其均数和标准差。计算畸形团芯片及周围脑组织芯片上各基因点的比值。取比值大于1.5或小于0.67的因子，归纳总结出表达水平有明显差异的基因。以realtime PCR方法对其中任意选取的2个基因进行验证。
　　结果:在113个Notch信号通路基因中，共筛选出27个明显变化的基因，其中，上调的4个，下调的23个。较为重要的基因包括:Notch信号通路配体DLL1、DLL3，受体及配体裂解关键基因ADAM10、ADAM17，Notch信号通路靶基因HES5，Notch相关的Sonic Hedgehog通路基因GLI1、Wnt信号通路基因FZD1、原癌基因LM02。realtime PCR验证DLL1和HES5两个基因，其检测结果与芯片结果基本相符。部分Notch信号通路关键基因在两个部位表达无差异。
　　结论:多个Notch信号通路基因在BAVM畸形团及周围脑组织存在差异表达，提示BAVM的发生发展与Notch信号通路有关。周围脑组织中，Notch信号通路亦可能存在异常。差异表达的基因可作为BAVM进一步研究的切入点。
　　第二部分新型钠钙交换蛋白NCEx等在大鼠脑出血模型中的表达变化
　　目的:观察新型钠钙交换蛋白NCEx、糖代谢相关蛋白—1(glucose metabolismrelated protein—1，GMRP-1)、细胞内钙离子浓度、Notch信号通路相关基因在大鼠脑出血模型中的表达变化，初步探讨细胞内钙离子浓度、NCEx与Notch信号通路的关系。
　　方法:建立大鼠自发性脑出血模型(EICH)后，进行四部分实验。1、realtime PCR法、Western blot法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核NCEx mRNA及蛋白表达水平;免疫组化法分析造模后6h、3天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核NCEx表达的形态学。2、Western blot法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天各时间点出血侧及对侧尾状核、对照组右侧尾状核GMRP-1蛋白表达水平。3、Fura—2/AM负载双波长荧光分光光度计法检测造模后6h、1天、3天、5天、7天出血侧及对照组右侧尾状核细胞内钙离子浓度。4、realtime PCR法测定造模后6h、3天、7天各时间点出血侧及对照组右侧尾状核Notch4和ADAM10 mRNA表达水平。
　　结果:1、正常情况下，NCEx mRNA在大鼠尾状核有一定量表达。在自发性脑出血模型造模后6小时，NCEx mRNA表达水平即下降;至造模后3天，其表达水平降至最低;造模后7天，表达水平回复至正常水平。造模后每个时间点，出血侧NCExmRNA的表达水平，都低于未出血侧。造模后3天时，与对侧相比，NCEx基因表达下降3倍。Western blot的结果与realtime PCR法检测结果相符。免疫组化显示自发性脑出血模型造模后各时间点，NCEx的染色都较正常组染色浅，且稀疏。染色最浅及稀疏的是造模后6h。造模后每个时间点，同对侧相比，NCEx的染色都较浅及稀疏。2、GMRP-1蛋白在正常大鼠尾状核有一定量表达。自发性脑出血模型造模后6小时，GMRP-1蛋白表达水平即下降;造模后第1至5天表达水平降至最低;造模后7天，表达水平复又升高。造模后各时间点，出血侧GMRP-1蛋白的表达水平都低于对侧;造模后第7天的表达水平同对侧的差别无统计意义。造模后1天时，与对侧相比，GMRP-1表达下降4倍左右。3、测得正常情况下尾状核细胞内钙离子浓度为(277.1±22.0)nmol/L。造模后6小时，胞内钙离子浓度即升高;造模后第3天，胞内钙离子浓度水平达(887.5±52.2) nmol/L，为正常值的3倍余;此后，水平开始下降。胞内钙离子浓度和NCEx蛋白表达量的相关系数r=0.66(P＜0.05)。4、正常情况下，ADAM10 mRNA及Notch4 mRNA在大鼠尾状核有一定量表达。在自发性脑出血模型造模后6小时，两者的表达水平即降至最低;造模后3天，表达水平开始升高;造模后7天，表达量高于正常水平。
　　结论:调节胞内钙离子浓度的NCEx、调控细胞凋亡与增殖的GMRP-1、调控细胞及组织新生、分化与重构的Notch信号通路因子Notch4和ADAM10在脑出血后呈现一定的变化规律。NCEx的表达水平和胞内钙离子浓度相关。NCEx、GMRP-1、Notch信号通路的动态表达水平，表明三者可能参与脑出血后早期钙超载引起的细胞功能障碍、细胞的凋亡及后期细胞与组织的新生、增殖与重构。
　　第三部分NCEx在缺氧培养人脑血管内皮细胞的表达研究
　　目的:通过研究缺氧培养的人脑血管内皮细胞(Human brain vascularendothelial cells，HBVEC)中NCEx的异常表达及细胞内钙离子浓度测定，初步探索缺氧、NCEx、胞内钙离子浓度和血管内皮功能异常之间的关系。
　　方法:复苏HBVEC并传代培养后，将细胞分为缺氧培养组及正常培养组，前者置于无氧培养箱中以普通培养基培养24小时，后者以普通培养条件培养。分别以Western blot法检测NCEx蛋白含量和Fura—2/AM负载双波长荧光分光光度计法检测胞内钙离子浓度。
　　结果:HBVEC成功复苏并传代。缺氧培养24小时，HBVEC漂浮死亡的细胞较少。正常培养的HBVEC表达一定量的NCEx;缺氧培养24h后，HBVEC的NCEx表达明显降低，为正常情况下表达量的0.16倍。缺氧培养24h后，细胞内钙离子浓度升高至2.2倍。
　　结论:普通培养液无氧培养箱中培养24h制作内皮细胞缺氧损伤模型切实可靠。缺氧可使HBVEC的NCEx mRNA表达下调，并使胞内钙离子浓度升高。两者水平的变化可能有关。

目录

本文常用缩略词表

摘要

引言

参考文献

第一部分 Notch信号通路在人脑动静脉畸形和周围脑组织中的差异表达

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 新型钠钙交换蛋白NCEx等在大鼠脑出血模型中的表达变化

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 NCEx在缺氧培养人脑血管内皮细胞的表达研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

全文小结

综述 Notch信号通路、血管内皮发育与血管病

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