大麻素受体在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的免疫调节作用与机理研究

摘要

第一部分：大麻素受体在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中的动态表达
　　目的：观察大麻素1型受体(cannabinoid receptor 1，CB1R)和大麻素2型受体cannabinoid receptor 2，CB2R)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)小鼠不同病程时期中枢神经系统(central nervous system，CNS)和外周免疫器官的动态变化。
　　方法：C57B/L6小鼠随机分为正常对照组、完全弗氏佐剂组(简称CFA组)和EAE组，观察不同组别小鼠的临床症状和体重变化；取脑、脊髓和脾脏组织，用realtime PCR检测CB1R和CB2RmRNA表达：用Western blot检测CB1R和CB2R蛋白表达。
　　结果：1、正常小鼠与CFA组小鼠脑和脊髓均有CB1R和CB2RmRNA和蛋白的表达，且表达水平在两组动物中无显著差异(P>0.05)，但CFA组小鼠脾脏中CB1R、CB2R的表达显著高于正常对照组(P<0.05)；2、EAE小鼠在病程不同时期，CNS中CB1R的表达水平显著低于相同时点的CFA小鼠(P<0.05)，而CB2R的表达则显著高于相同时点的CFA小鼠(P<0.05)；EAE小鼠脾脏中CB1R和CB2R的表达尽管也显著高于正常对照组，但与相同时点的CFA小鼠均无显著性差异(P>0.05)；3、EAE小鼠不同组织中CB1R和CB2RmRNA的表达水平与蛋白表达水平一致；CB1R的表达水平与EAE的发病程度呈负相关。
　　结论：1、正常小鼠CNS和外周免疫器官均表达CB1R和CB2R。2、EAE小鼠CNS中CB1R表达下降，而CB2R升高，推测CB1R神经保护作用的降低和CB2R免疫炎症调节作用的增加可能参与了EAE的发生和发展。3、EAE小鼠脾脏中CB1R和CB2R显著升高没有疾病特异性，可能与非特异性免疫激活有关。
　　第二部分：大麻素受体在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用研究
　　目的：探讨CB1R特异性拮抗剂SR141617A(SR1)和CB2R特异性拮抗剂SR144528(SR2)对EAE病程发生发展的作用及机理。
　　方法：EAE小鼠随机分为空白对照组，溶剂对照组，SR1干预组和SR2干预组。观察不同组别小鼠的临床症状和体重变化：取脑、脊髓和脾脏组织，用realtimePCR技术检测CB1R和CB2RmRNA表达；用Western blot检测CB1R和CB2R蛋白表达；用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测细胞因子和趋化因子的水平；应用四甲基偶氮唑盐(3-(4，5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT)法检测脾脏特异性T细胞增殖。
　　结果：1、SR1干预的EAE小鼠临床评分在发病早期显著高于溶剂对照组，并伴随体重显著降低(P<0.05)；SR2干预的EAE小鼠临床评分在发病高峰期后显著高于溶剂对照组，并伴随体重显著降低(P<0.05)；2、SR1显著抑制了CB1R表达，但却促进了CB2R表达；SR2在抑制CB2R表达的同时促进了CB1R的表达；3、SR1可上调EAE发病高峰期脑和脊髓组织以及脾脏抗原特异性T细胞致炎因子(IFN-γ、IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α)和趋化因子MCP-1的水平；4、SR2可上调EAE发病高峰期脑、脊髓和脾脏中抗原特异性T细胞Th1/Th17细胞因子以及趋化因子MCP-1和CX3CL1水平，下调Th2细胞因子水平；5、SR1干预的EAE小鼠脾脏抗原特异性T细胞增殖在发病高峰期显著高于溶剂对照组(p<0.05)，而SR2干预的EAE小鼠脾脏抗原特异性T细胞增殖在发病高峰期和缓解期均显著高于溶剂对照组(p<0.05)。
　　结论：1、SR1使EAE发病提前，但不加重EAE发病高峰期之后的临床症状；2、SR2显著加重EAE发病高峰期之后的临床表现，疾病呈现不易缓解的趋势；3、SR1和SR2均可导致脑、脊髓和脾脏组织中CB1R/CB2R的表达失衡；4、SR1和SR2可分别上调炎性细胞因子和趋化因子以及抗原特异性T细胞增殖反应，SR2可下调IL-10产生。
　　第三部分：EAE小鼠病程中神经元、胶质细胞大麻素受体水平的动态变化
　　一、原代神经元和胶质细胞大麻素受体的表达
　　目的：观察原代神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞CB1R和CB2R的表达。
　　方法：取孕18天胎鼠的海马培养神经元，取24小时新生小鼠的皮层培养星形胶质细胞和小胶质细胞。用realtime PCR检测CB1R和CB2RmRNA的表达，用Western blot检测CB1R和CB2R蛋白的表达，用荧光免疫组织化学方法观察不同细胞CB1R和CB2R的表达。
　　结果：原代培养的神经元和小胶质细胞均有CB1R和CB2R的表达，但星形胶质细胞仅有CB2R表达。
　　结论：不同神经细胞表达不同类型的CBR。
　　二、EAE小鼠病程中神经元和胶质细胞大麻素受体的表达变化
　　目的：观察CBR拮抗剂干预后CB1R和CB2R在EAE小鼠病程中神经元和胶质细胞的表达变化，探讨大麻素受体在EAE发生发展中的作用。
　　方法：C57B/L6小鼠随机分为正常对照组、CFA组和EAE组。其中，EAE小鼠随机分为溶剂对照组，SR1干预组和SR2干预组。用荧光免疫组织化学方法分别双染不同组别小鼠神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和CB1R/CB2R；用Image-ProPlus6.0软件分析EAE不同时期CB1R和CB2R阳性细胞数的变化。
　　结果：1、CB1R主要在神经元上表达，小胶质细胞有少量表达，星形胶质细胞不表达；CB2R主要在星形胶质细胞和小胶质细胞上表达，神经元有少量表达；2、与相应时点的CFA小鼠比较，EAE小鼠神经元CB1R的表达显著降低(P<0.05)，星形胶质细胞CB2R的表达显著升高(P<0.05)；小胶质细胞CB1R与CB2R的表达均显著升高(P<0.05)；3、SR1显著抑制神经元和小胶质细胞CB1R的表达，但上调小胶质细胞CB2R的表达；SR2显著抑制神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞CB2R的表达，但上调神经元CB1R的表达。
　　结论：1、不同细胞表达不同类型的CBR；2、EAE不同时期不同细胞类型的CBR表达变化存在差异；3、SR1可诱导小胶质细胞CB1R和CB2R表达失衡；SR2可诱导神经元CB1R和CB2R表达失衡；4、本研究结果提示CB1R和CB2R在EAE发生发展中可能分别发挥不同的作用。
　　第四部分：大麻素受体在激活态BV2小胶质细胞免疫炎症调节中的作用
　　目的：探讨CBR在激活态BV2小胶质细胞免疫炎症调节中的作用。
　　方法：用IFN-γ刺激BV2小胶质细胞，将激活后的BV2小胶质细胞随机分为vehicle组，SR1干预组，SR2干预组，WIN-2(CBR非选择性激动剂)组，WIN-2+SR1组和WIN-2+SR2组。用realtime PCR检测CB1R和CB2RmRNA表达，Western blot检测CB1R和CB2R蛋白表达，ELISA检测细胞因子和趋化因子的水平；MTT法检测各组细胞的增殖。
　　结果：1、IFN-γ刺激可明显上调BV2小胶质细胞CB1R和CB2RmRNA和蛋白的表达；WIN-2可进一步刺激CB1R和CB2R的表达增加(P<0.05)；2、比较于溶剂对照组，SR1显著上调BV2小胶质细胞IFN-γ、IL-6、TNF-α的水平(P<0.05)，下调IL-17的浓度(P<0.05)，促进BV2小胶质细胞一氧化氮(nitricoxide，NO)释放(P<0.05)：3、比较于溶剂对照组，SR2显著上调BV2小胶质细胞Th1/Th17细胞因子和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，下调Th2细胞因子和趋化因子CX3CL1的水平(P<0.05)，促进BV2小胶质细胞增殖和NO释放(P<0.05)。
　　结论：SR1和SR2可能通过促进细胞增殖和/或促进小胶质细胞释放NO等环节参与调节了Th1/Th17/Th2细胞因子、炎性因子和趋化因子的水平。
　　结论：
　　1、神经元和小胶质细胞均表达CB1R和CB2R，星形胶质细胞只表达CB2R。
　　2、EAE病程中，脑、脊髓组织CB1R(神经保护)表达减少，而CB2R(免疫调节)表达增多，可能与EAE的发生发展有关。
　　3、SR1导致EAE小鼠小胶质细胞CB1R/CB2R表达失衡，而SR2导致神经元CB1R/CB2R表达失衡；CB1R和CB2R在EAE发生发展中可能分别发挥不同作用。
　　4、SR1可能通过上调Th1，炎性因子的分泌，使EAE发病提早；SR2可能通过上调Th1/Th17和炎性因子的分泌，下调Th2因子分泌导致EAE的恶化。CB1R和CB2R均参与了中枢和外周的免疫调节作用。
　　5、SR1和SR2可能通过促进BV2小胶质细胞增殖和/或促进BV2小胶质细胞释放NO等环节参与调节了Th1/Th17/Th2细胞因子、炎性因子和趋化因子的水平。