左乙拉西坦对CD8+T淋巴细胞凋亡和细胞毒性功能的影响

摘要

目的:以往的临床研究显示，接受左乙拉西坦(LEV)治疗的患者常常伴有较高的感染发病率（主要是感冒），但机制不明。在我们的前期临床试验中，发现接受左乙拉西坦治疗的患者外周静脉血中CD8+T淋巴细胞计数有下降的趋势。本研究的重点是调查左乙拉西坦在体外对CD8+T淋巴细胞凋亡和细胞毒性功能的影响，同时与丙戊酸钠进行比对(VPA)。
　　方法:分离外周血单核细胞，在不同药物浓度下观察左乙拉西坦和丙戊酸钠对CD8+T淋巴细胞凋亡和病毒多肽(CEF)诱发的细胞毒性功能的影响。采用的药物浓度分别是:左乙拉西坦5或50 mg/L，丙戊酸钠10或100 mg/L。外周血单核细胞分别在以上药物浓度下体外培养1h和24h，采用流式细胞仪对比观察凋亡率，CD8+T淋巴细胞的凋亡定义为CD3+/CD8+/Annexin+/PI-。在细胞毒性功能的研究中，病毒多肽诱导特异性CD8+T淋巴细胞的激活后，在不同药物浓度下，采用流式细胞仪对比观察穿孔素释放、CD107+表达率和CFSE稀释法显示的细胞增生。CD8+T淋巴细胞的脱颗粒效应通过细胞内的穿孔素减少和细胞表面的CD107+增加来表示。采用流式细胞仪分析和Westernblot分析检测SV2A在人CD8+T淋巴细胞中的表达。
　　结果:在病毒多肽刺激后2h，高浓度(50 mg/L)和低浓度(50mg/L)的左乙拉西坦均显著抑制了CD8+T淋巴细胞的穿孔素释放(LEV50 mg/L vs CEF:25.8±12.9％ vs18.2±9.7％, p＜0.01; LEV5mg/L vs CEF:24.1±13.7％ vs18.2±9.7％，p＜0.01;n=15)和CD107+表达率的增加(LEV50mg/L vs CEF:5.3±2.5％ vs11.5±4.7％, p＜0.01; LEV5mg/L vs CEF:6.7±2.2％ vs11.5±4.7％，p＜0.01;n=15)，但在病毒多肽刺激后5h，仅有高浓度(50 mg/L)的左乙拉西坦保持了针对CD107+表达率增加的抑制效应(LEV50mg/L vs CEF:13.97±4.71％ vs18.43±6.68％，p＜0.05;n=15)。左乙拉西坦对CD8+T淋巴细胞的凋亡和病毒多肽诱导的增生无明显影响(p＞0.05)。高浓度的丙戊酸钠(100mg/L)显著抑制了CD8+T淋巴细胞在体外的自发性凋亡(VPA100mg/L vs对照组:7.8±3.4％ vs11.5±4.2％，p＜0.01，n=15)，但丙戊酸钠组未显示其他具有统计意义的效应差异(p＞0.05)。人CD8+T淋巴细胞中存在SV2A。
　　结论:我们的研究发现，左乙拉西坦对病毒多肽诱导的CD8+T淋巴细胞脱颗粒反应具有中度的抑制效应。这一发现不仅有助于解释左乙拉西坦治疗伴发的高感染率，而且提示了左乙拉西坦的一种新的抗癫痫机制，即有可能通过减少穿孔素的释放而减轻血脑屏障的破坏。SV2A在人CD8+T淋巴细胞中的表达有助于上述现象的解释。

目录

摘要

主要缩写

前言

1 目标问题概述

2 左乙拉西坦(LEV)

2．1 药物动力学和药效动力学

2．2 作用机制

2．3 临床抗癫痫效应

2．4 不良反应

3 丙戊酸钠(VPA)

4 CD8+T淋巴细胞的抗病毒功能

5 小结

参考文献

第一部分 目标免疫细胞和细胞因子的前期临床筛选

1 方法

1．1 病人和血液采集

1．2 试剂与抗体

1．3 流式细胞仪检测

1．4 ELISA检测

1．5 统计分析

2 结果

3 结论

第二部分 LEV与VPA对CD8+T淋巴细胞凋亡的影响

1 方法

1．1 试剂与抗体

1．2 抗癫痫药物

1．3 分离外周血单核细胞(PBMCs)

1．4 抗癫痫药物刺激PBMCs

1．5 凋亡评估

1．6 统计分析

2 结果

3 结论

参考文献

第三部分 LEV与VPA对CD8+T淋巴细胞细胞毒性功能的影响

1 方法

1．1 试剂与抗体

1．2 抗癫痫药物

1．3 分离外周血单核细胞(PBMCs)

1．4 病毒多肽

1．5 穿孔素释放试验

1．6 CD107显示的脱颗粒分析

1．7 CFSE稀释法显示CD8+T淋巴细胞的增生

1．8 统计分析

2 结果

2．1 CEF多肽激活CD8+T淋巴细胞

2．2 穿孔素释放

2．3 CD107a／b细胞表面表达

2．4 细胞增生

3 结论

参考文献

第四部分 SV2A在人CD8+T淋巴细胞中的表达

1 方法

1．1 试剂与抗体

1．2 分离外周血单核细胞

1．3 流式细胞仪分析

1．4 Westernblot分析

2 结果

3 结论

参考文献

讨论

1 关于方法学的讨论

2 抑制脱颗粒反应对抗病毒免疫的影响

3 抑制穿孔素释放对抗癫痫作用的影响

4 高浓度VPA的抗凋亡作用

5 SV2A在人CD8+T淋巴细胞中表达的初步研究

6 局限性

7 小结

参考文献

综述：Cytokines and epilepsy．Seizure 2011，20(3)：249-56

致谢

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