雌激素经PI3K/AKT信号传导通路调控E-cadherin、a-actinin-4促进shRNA ERa/βSKOV3干扰株转移的研究

摘要

卵巢癌是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，死亡率最高、疗效最不满意、预后最差，严重威胁妇女健康。在卵巢原发性恶性肿瘤中，60-90％是上皮性癌，随着肿瘤细胞减灭术的广泛开展，铂类、紫杉醇类及新化疗药物的不断出现，以及化疗方案的不断改进，卵巢癌的治疗效果大为改观，病人的生存质量明显改善，但5年生存率仍徘徊在30％～50％左右。卵巢是雌激素的分泌器官，又是雌激素的靶器官，雌激素对卵巢肿瘤的生长、转移影响已受到多方关注。目前的一些研究发现，雌激素对卵巢上皮性肿瘤的转移具有一定促进作用，而该作用很可能是雌激素通过除特异性受体以外的途径调控一系列肿瘤基因来达到。本课题组前期研究结果表明雌激素可促进卵巢癌细胞转移，并且可通过非经典途径PI3K/AKT信号传导通路实现。
　　此次研究在课题组前期研究的基础上，拟了解在雌激素受体被敲除后，雌激素是否可不通过特异性受体介导的经典途径，激活非经典途径PI3K/AKT通路影响卵巢癌细胞的转移。
　　课题共分两大部分:1.体外试验:采用分子生物学技术，了解在雌激素受体被敲低后，雌激素经PI3K/AKT信号传导通路对shRNA ERa/β SKOV3干扰株转移侵袭的影响及对E-cadherin、a-actinin-4蛋白的调控作用;2.动物实验:了解雌激素及AKT信号传导通路抑制剂对shRNA ERa/β SKOV3干扰株移植瘤播散转移的影响。为临床理解雌激素对卵巢癌影响的作用机制提供理论依据，探讨AKT信号传导通路抑制剂应用的效果，为卵巢癌的防治新策略提供科学依据。
　　Ⅰ.体外研究:雌激素通过激活PI3K/AKT非经典途径调控肿瘤转移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白的表达促进shRNAERa/β SKOV3干扰株细胞的转移
　　目的:研究雌激素通过PI3K/AKT非经典途径对shRNA ERa/β SKOV3干扰株转移的影响及对肿瘤转移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白表达的调控。
　　方法:采用慢病毒质粒干扰的方法构建shRNA ERa/β SKOV3干扰株;使用蛋白印迹法检测雌激素作用后pAKT、AKT蛋白表达的改变;使用Transwell试验评价雌激素及LY294002对shRNA ERa/β SKOV3干扰株转移能力的影响;使用蛋白印迹法、共聚焦实验检测雌激素及LY294002作用后pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4蛋白表达的改变。
　　结果:经Western blot结果提示17-β雌二醇能增加pAKT蛋白表达，并存在时间和浓度依赖性，但不改变AKT蛋白表达;Transwell试验结果证明当shRNAERa/β SKOV3干扰株细胞在transwell小室培养48h后，雌激素组穿过transwell小室的shRNA ERa/β SKOV3干扰株细胞数量较control组多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。当PI3K/AKT途径被抑制时，雌激素促进转移的作用被减弱:Transwell试验结果证明当shRNA ERa/β SKOV3干扰株细胞在transwell小室培养48h后，E+LY294002组穿过transwell小室的shRNA ERa/β SKOV3干扰株细胞数量较雌激素组少，差异具有统计学意义(P＜0.05)，较LY组多，差异具有统计学意义(P＜0.05);Western blot结果提示:17-β雌二醇作用后，较control组E-cadherin表达下降，胞浆中a-actinin-4表达增加;雌激素+LY294002联合作用后，较单用LY294002组pAKT表达程度高，E-cadherin表达下降，胞浆中a-actinin-4表达增加;胞核中的a-actinin-4表达在LY294002组最为明显;经共聚焦结果提示LY294002组E-cadherin浆膜表达最明显，a-actinin-4浆膜表达最不明显;当E+LY294002联合作用时，较LY294002组E-cadherin浆膜表达明显下降、a-actinin-4浆膜表达明显增加。
　　结论:在雌激素受体被敲低后，17-β雌二醇能激活PI3K/AKT非经典途径，并且通过该途径进一步调控肿瘤转移因子E-cadherin、a-aetinin-4蛋白的表达从而影响肿瘤细胞转移。
　　Ⅱ.动物实验:雌激素及LY294002对shRNA ERa/βSKOV3干扰株移植瘤播散转移的影响
　　目的:研究雌激素及LY294002对shRNA ERa/β SKOV3干扰株移植瘤播散转移的影响。
　　方法:shRNA ERa/β SKOV3干扰株细胞连续培养传代后调整浓度为5×107个/ml取0.2ml注射于20只裸鼠腹腔，随机分为4组，每组5只。2周后处理如下:
　　(1)空白组:腹腔注射PBS+DMS00.2ml/2天(DMSO占25％)+肌肉注射食用油0.1ml/4天;
　　(2)雌激素组:肌肉注射2μg苯甲酸雌二醇（食用油稀释至0.1ml）/4天;
　　(3) LY294002组:腹腔注射1mg LY294002(用PBS+DMSO稀释至0.2ml，DMSO占25％)/2天;
　　(4)雌激素+LY294002组:腹腔注射1mg LY294002（用PBS+DMSO稀释至0.2ml，DMSO占25％）/2天，肌肉注射2μg苯甲酸雌二醇(食用油稀释至0.1ml)/4天。
　　用药期间观察各组裸鼠腹围变化、记录体重变化，一个月后将各组裸鼠处死，观察各组裸鼠腹腔移植瘤播散情况、比较各组裸鼠移植瘤重量、移植瘤组织pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4表达情况。
　　结果:各组裸鼠在注射药物后，出现不同程度行动迟缓、反应迟钝，但对外界的刺激有较好的反应。各组裸鼠体重变化无明显差异(P＞0.05)。雌激素组裸鼠腹部膨隆最明显，移植瘤体积最大、个数最多、播散最为广泛，腹壁、肠曲间、肝脏、脾脏均有移植瘤生长，其中有一只裸鼠的移植瘤扩散到胸腔;LY294002组裸鼠的移植瘤体积最小、个数最少、播散最为局限，主要以肠曲间及肝脏为主。雌激素组移植瘤重量较control组大，且有统计学差异(P＜0.05); LY294002组移植瘤重量较control组及雌激素组均小，且均有统计学差异(P＜0.05);雌激素+LY294002组移植瘤重量较LY294002组大，且有统计学差异(P＜0.05)。免疫组织法检测各组裸鼠腹腔移植瘤组织中pAKT、AKT、E-cadherin、a-actinin-4的表达，结果提示:LY294002组、E2+LY294002组移植瘤pAKT的表达明显低于E2组（P＜0.05);control组、LY294002组、E2+LY294002组移植瘤E-cadherin的表达较E2组高（P＜0.05）;a-actinin-4在E2组以胞浆表达为主，在LY294002组以胞核表达为主;AKT在各组移植瘤的表达无明显变化(P＞0.05)。
　　结论:雌激素能促进裸鼠SKOV3干扰细胞株腹腔移植瘤生长、播散，LY294002对其有抑制作用。
　　综上所述，当ERa/β被敲低时，17-β雌二醇能激活PI3K/AKT非经典途径，并且通过该途径进一步调控肿瘤转移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白的表达从而影响肿瘤细胞转移，且能促进shRNA ERa/β SKOV3干扰细胞株腹腔移植瘤的播散转移，LY294002对其有抑制作用。

目录

摘要

前言

Ⅰ．体外研究：雌激素通过激活PI3K／AKT非经典途径调控肿瘤转移因子E-cadherin、a-actinin-4蛋白的表达促进shRNA ERa／β SKOV3干扰株的转移

(一)在卵巢癌细胞SKOV3中构建慢病毒载体介导的干扰ERa／β受体基因的稳定表达株

材料与方法

结果

(二)雌激素通过激活PI3K／AKT信号传导通路调控E-cadherin、a-actinin-4蛋白表达促进shRNA ERa／β SKOV3干扰株细胞转移

材料与方法

结果

讨论

Ⅱ．动物研究：雌激素及LY294002对shRNA ERa／β SKOV3干扰株细胞移植瘤播散转移的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

展望

参考文献

综述 PI3K／Akt信号传导通路与卵巢癌治疗研究进展

研究生期间发表的论文

致谢

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