整合素ανβ5合并EGFR检测用于非小细胞肺癌转移及预后评估的研究

摘要

目的：
　　据WHO2013年1月最新统计数据显示，癌症依旧是全世界导致死亡的首位原因。在2008年，共有760万人死于癌症，WHO预计2030年全世界癌症死亡人数会上升到1300万。目前在我国高发癌症中，肺癌死亡率从2000年跃居第1位，上升最为明显。
　　肺癌转移是导致死亡主要原因，是目前肿瘤研究领域面临的主要挑战之一。由肿瘤引起的所有死亡中接近90％与原发肿瘤的转移性扩散相关。预测肺癌转移、有助于筛选出具有高风险因素人群的生物学标志物将帮助肺癌患者延长预后、选择更合适的治疗方案。
　　在所有肺癌病例中，约有80-85％是非小细胞肺癌。60％-70％非小细胞肺癌患者就诊时已处于ⅢB期或Ⅳ期，已失去根治性治疗的机会，只能采用化疗来缓解症状、延长生存期，但目前的化疗有效率较低，毒副反应大。因此，分子靶向治疗逐渐成为非小细胞肺癌患者治疗的又一重要手段，是目前抗肺癌药物研发的方向和挑站。
　　目前应用于肺癌临床治疗的分子靶向治疗方法主要是针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂，可以使晚期非小细胞肺癌瘤体缩小，患者生存期延长，同时具有并发症少等特点。如果研发上可以重点突破治疗癌症转移的药物，临床上使用联合用药，患者将会收到更好的疗效.
　　整合素和表皮生长因子受体的相互作用在肿瘤的发生，增殖，迁移以及侵袭中发挥了重要的作用。癌症条件下，表皮生长因子受体信号通路的高度激活加速肿瘤细胞迁移和转移。表皮生长因子受体能促进肿瘤细胞体外迁移和体内转移的过程需要整合素αvβ5的参与。本临床试验研究旨在验证此假设，为许多肿瘤疾病的治疗和药物研发提供理论依据。
　　目前还没有关于整合素αvβ5对人体非小细胞肺癌的免疫组化研究的报道。对此的进一步研究可以帮助研发靶向药物提供病人入组的筛选平台。而且，目前临床研究这种生物标记是否与临床预后和转移相关也没有报道。同时进一步为研发提供指导意义，本研究第一次提供关于表皮生长因子受体突变和整合素αvβ5阳性患者重合比例的临床数据.因此此项研究有助于专业人员为非小细胞肺癌转移病人制定更加有效的治疗方法。
　　材料与方法：
　　病人入组：
　　本实验入组了2005年到2007年间复旦大学中山医院147例住院手术的非小细胞肺癌患者。被选定的患者需要完整的临床资料:病人编号，年龄，性别，非小细胞肺癌类型(SCC，AC或其他)，临床病理分级（高，中，低），总生存期，TNM分期和转移状态。收集所有患者的癌组织进行进一步研究。
　　同时也入组了参与其他临床实验的32位非小细胞肺癌患者，收集了的癌旁紧邻正常组织进行研究，并与147位患者相同条件下采集病理组织和收集临床信息。
　　筛选病人标准：
　　所选病人必须满足以下条件:
　　任何参加入组的患者必须签署书面知情同意书。
　　男性或女性，18岁以上。
　　所选病人之间不能是直系亲属关系。
　　所有患者均经病理诊断为原发性肺癌患者，所选病例病理类型均为非小细胞肺癌患者。
　　手术前没有进行辅助/新辅助化疗或放疗。
　　所有患者手术方式均采用肺叶切除术或者全肺切除术，均包含淋巴结清扫，均采取非姑息治疗手术方案。
　　所有患者术后均于本院随访治疗，存活期间随访时间大于五年。
　　所有样品均按照标准程序进行石蜡包埋，以及保存，进行以下三种实验:H＆E染色，免疫组化和表皮生长因子受体检测。
　　免疫组化分析方法的建立：
　　对以上两组病人的手术标本肿瘤和正常组织都同时进行免疫组化研究，分析比较两者的表达差异有没有统计学的意义。
　　免疫组化实验按照DAKO自动染色机的经过优化的标准流程进行操作，并对相同的组织进行重复实验以确定整合素αvβ5特异性染色。兔源性单克隆αvβ5抗体以1∶300稀释，同时设立阳性对照和阴性对照组。
　　本实验参照美国食品医药管理局的标准要求，两位参与此项研究的病理学专家对研究结果评估的一致性概率必须≥85％，以保证结果的重复性和准确性。
　　EGFR基因检测：
　　对147例患者样本EFGR基因突变进行检测。选取一张空白切片进行H&E染色以确定肿瘤组织和正常组织，石蜡包埋组织切片应在一周内完成EGFR基因检测以保证DNA提取的质量。为了确保DNA的纯度，在实验过程中（取样，固定，包埋），我们进行了优化流程以保证组织的质量，而且严格控制用于DNA提取的切片保存条件（湿度，时间，温度）。
　　设计引物进行PCR。取1μL质粒或3-5μL PCR产物进行凝胶电泳(≤0.75％)检测DNA浓度和纯度。PCR条件为:(55-60℃)，延伸(50-72℃)，68-72℃，1s每100bp。同时设立阳性对照和阴性对照。对突变质粒进行测序验证EGFR基因外显子18，19，20，21突变。经过30年的提高和技术进步，目前Sanger生化技术能够获得99。999％精准率。
　　统计分析：
　　结果采用R.version2.15.2(2012-10-26)统计分析软件进行统计分析。应用Pearson chi-square检验比较整合素αvβ5阳性和阴性患者，获得阳性和阴性患者的临床病理特征。使用Wilcoxon秩和检验比较肿瘤组织和非肿瘤组织中整合素αvβ5的表达水平。
　　采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检测进行生存分析。总生存时间是从手术当天开始计算，到死亡为止。通过对单变量和多变量生存分析进行COX回归来分析单个临床参数与总存活期之间的关系。除了年龄，性别，和明确的预后结果（肿瘤形状，肿瘤分期）之外，以p＜0.05为显著性差异。计算EGFR突变的阳性率以与整合素αvβ5阳性率进行相关性评估。
　　结果：
　　147位患者的平均存活时间是42个月。本项研究首次提出与非小细胞肺癌有关的整合素αvβ5免疫组化表达。本项研究首次证明整合素αvβ5是非小细胞肺癌转移的标志物(p＜0.011)。同时，癌症分期(P＜0.027)和癌症类型(P＜0.007)不同整合素αvβ5阳性表达也不同。但是，整合素αvβ5的表达与性别，年龄，病理分级无关。
　　收集32位患者非肿瘤癌旁组织进行免疫组化染色来确定肿瘤和非肿瘤组织的表达水平。使用Wilcoxon秩和检验来比较整合素αvβ5的表达差异，结果发现表达明显不同(P＜0.0023)证明目前免疫组化的方法具有特异性和敏感性。
　　使用Kaplan-Meier来分析病人的总存活期与整合素αvβ5表达之间的关系。阳性表达（2+/3+）患者的总存活时间明显少于阴性表达(0，1+)患者(P＜0.029)，由此可以评判整合素αvβ5可作为非小细胞肺癌患者的预后生物标记物。
　　根据单因素回归分析发现总存活时间与整合素αvβ5阳性/阴性表达相关(P＜0.0317);与淋巴转移(P＜0.0001);病理分级(P＜0.0065);疾病分期(P＜0.0001)和肿瘤组织大小(P＜0.0001)有统计意义正相关，但是与性别，年龄，癌症类型无关。应用多因素回归分析发现总存活时间与临床因素(淋巴结转移除外(P＜0.0064))之间没有显著相关性。
　　EGFR突变的表达在78例腺癌里，几乎没发现在59例鳞癌和10例其他亚型中有突变是与目前的对中国患者的报道一致的。而且突变患者中女性多于男性也和报道一致，本实验男性26.4％，女性59.5％。
　　当同时分析EGFR突变和整合素αvβ5两个生物标记物，使用Kaplan-Meier来分析病人的总存活期与它们的关系发现具有统计学意义(P＜0.0257)。两个生物标记物都是阳性时患者的生存期最短，当整合素αvβ5阳性EGFR阴性时，生存期其次。当整合素αvβ5阴性时，无论EGFR阳性或阴性最后的总存活期几乎一致。这个结果充分证实了本课题的开题假设:癌症条件下，表皮生长因子受体信号通路的高度激活加速肿瘤细胞迁移和转移。表皮生长因子受体能促进肿瘤细胞体外迁移和体内转移的过程需要整合素αvβ5的参与。
　　从所有以上结果来看，预后与研究表明12.3％的病人既是表皮生长因子受体阳性表达同时也是整合素αvβ5阳性表达，这有助于将来对病人的筛选和治疗。
　　结论：
　　1.本项研究表明整合素αvβ5是非小细胞肺癌转移和预后的生物标记物。
　　2.整合素αvβ5可用于非小细胞肺癌及其他癌症的治疗靶点开发靶向药物。
　　3.整合素αvβ5免疫组化染色方法可以用于对病人的筛选。
　　4.12.3％的病人阳性表达表皮生长因子受体和整合素αvβ5，这表明将来可能可以应用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂和整合素αvβ5拮抗剂来治疗非小细胞肺癌并防止其转移。

目录

声明

Table of Tables

Table of Figures

Abbreviation

摘要

ABSTRACT

1 Introduction

1．1 Integrin receptors

1．2 Mechanism of integrins regulate tumour angiogenesis promote metastasis

1．2．1 Integrins regulate tumor angiogenesis

1．2．2 Integrin enhance cell survival or apoptosis

1．2．3 Integrins control the host cells response to cancer

1．2．4 Integrins cooperate with oncogenes for tumor growth and invasion

1．2．5 Integrins corss talk with growth factors

1．3 Design anti-cancer therapeutic agents to target αv integrins

1．4 Additional integrin αv antagonists

2 Integrin αvβ5 as a biomarker for NSCLC metastasis and overall survival

2．1 Material and Method

2．1．1 Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) tissue samples

2．1．2 Reagents and materials

2．1．3 Instruments

2．1．4 Methods

2．1．5 Results evaluation

2．1．6 Statistical analysis

2．2 Results

2．2．1 Patient clinical information and integrin αvβ5 expression levels

2．2．2 Integrin αvβ5 IHC staining and Clinicopathological features

2．2．3 Integrin expression level comparison in cancer tissue andnormal tissue

2．2．4 Integrin expression level relates to overall survival

3 Integrin αvβ5 cross talk with EGFR in non-small cell lung cancer

3．1 Material and Method

3．1．1 Extract cancer tissue from the FFPE cutting slides

3．1．2 DNA extraction

3．1．3 Quantifying DNA

3．1．4 PCR amplification

3．1．5 Sequencing(ABI3730)

3．1．6 Statistical analysis

3．2 Results

3．2．1 Patient clinical information and EGFR mutation positive and negative ratio

3．2．2 EGFR positive and negative not relates to overall survival

3．2．2 Combination biomarkers and therapies

4 summary

References

Publications during study

Acknowledgement