LSD1介导的组蛋白H3K4去甲基化对雄激素受体调控靶基因转录的影响

摘要

雄激素受体(AR)是一个转录因子，它可以调控其下游靶基因的转录表达过程，并且它在前列腺癌的恶化发展过程中起着重要作用。和雄激素结合后，AR进入细胞核，和染色质上特定的DNA片段——雄激素反应元件(ARE)结合，发挥其功能。在本论文的研究中，我们发现AR和染色质片段的结合引发了赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)介导的组蛋白3的4位赖氨酸的去甲基化过程。去甲基化过程产生了过氧化氢等活性氧组分(ROS)，它是一种对细胞生理有害的物质，可以氧化DNA链上较为脆弱的鸟嘌呤成为8氧鸟嘌呤，ROS的产生引起了8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)以及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(Ape1)等核酸修复通路酶与染色质增强子，启动子区域的结合，来消除活性氧对细胞造成的损伤，确保AR靶基因转录过程的顺利进行。在这个过程中，RNA聚合酶Ⅱ以及拓扑异构酶Ⅱ等辅助蛋白因子和AR，LSD1，Ape1，OGG1一起形成转录复合物，参与转录过程。
　　在本论文中，我们使用具有抗氧化剂活性以及氧化酶抑制剂活性的药物对前列腺癌细胞进行处理，实验证明阻碍氧化过程会使得AR靶基因:PSA，TMPRSS2，miR-125b2以及miR-133b的表达量显著下调，这其中，miR-133b是课题组前期通过生物信息学方法预测的AR直接调控的靶基因。用siRNA对LSD1，OGG1和Topoisomerasell进行干扰，也同样可以抑制上述AR靶基因的转录。通过染色质免疫沉淀实验我们检测到了LSD1，OGG1，Ape1，TopoisomeraseⅡ和RNAPⅡ在受到雄激素刺激后在染色质相关区域结合的增加，在用siRNA对LSD1进行干扰后，检测到了OGG1，TopoisomeraseⅡ和RNAPⅡ结合的减少，说明了AR受到雄激素刺激后发挥功能，招募LSD1到染色质相关区域，而LSD1介导的去甲基化又招募其它蛋白辅助因子到染色质上，共同构成了转录复合物，维持AR靶基因转录的正常进行。考虑到不同辅助蛋白因子可能会结合到染色质的不同增强子区域，而各个增强子之间的距离可能很远，我们认为临时的基因线环这种空间结构的形成促成了转录复合物的形成，同时DNA链的氧化损伤也消除了线环形成的空间阻力，所以基因线环的形成应该是一个伴随DNA氧化损伤/修复的瞬时和动态循环的过程，我们通过染色体结构捕捉实验(3C)检测到了基因线环的形成和消失，验证了这种观点的真实性。
　　总结来说，本论文的实验证明了在雄激素受体调控通路中，LSD1介导的H3K4去甲基化过程产生了活性氧组分，造成了DNA链的损伤;OGG1，Ape1等损伤修复酶被招募到染色质特定区域，修复氧化损伤;同时临时的基因线环结构形成来促进包含了AR，LSD1，OGG1，Ape1，TopoⅡ和RNAPⅡ等转录因子和蛋白辅助因子的转录复合物的形成，维持AR靶基因转录的正常进行。在整个模型中，AR招募LSD1结合到染色质相关区域，LSD1介导组蛋白去甲基化并生成活性氧组分并招募DNA氧化损伤修复酶。根据这个过程，我们得出结论:去甲基化，DNA氧化损伤，氧化损伤修复，以及基因线环结构的形成对于AR调控的miR-125b2和miR-133b的正常转录都是必不可少的。实验结果也从另一个方面证实了，miR-133b是AR直接调控的靶基因。同时，这些表观遗传方面的实验结论也为AR调控通路的研究提供了新的视角，为前列腺癌的发生恶化以及治疗过程的研究提供了新的思路。

目录

摘要

英文缩略词列表

引言

第一部分 研究背景

1．1 雄激素受体(AR)调控通路介绍

1．2 表观遗传学修饰和AR调控通路的关系

1．3 DNA氧化损伤／修复过程对AR调控通路的影响

1．4 AR靶基因区域基因线环结构的形成对于转录的影响

第二部分 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料，酶，抗体

2．1．2 细胞系

2．1．3 试剂配制

2．1．4 仪器设备

2．1．5 引物序列和siRNA序列

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞瞬时转染

2．2．3 细胞总RNA的提取

2．2．4 逆转录

2．2．5 实时荧光定量PCR(qPCR)

2．2．6 染色质免疫沉淀

2．2．7 染色体结构捕捉(3C)

2．2．8 Western Blot

第三部分 实验结果

3．1 实验中涉及的AR调控靶基因基本情况

3．1．1 PSA(前列腺特异性抗原，prostate specific antigen)

3．1．2 TMPRSS2

3．1．3 miR-125b2

3．1．4 miR-133b

3．2 AR靶基因的表达受组蛋白去甲基化以及DNA氧化损伤过程的影响

3．3 AR调控靶基因的表达量受到LSD1，OGG1和Topoisomerase Ⅱ的表达量影响

3．4 AR招募LSD1结合到染色体的特定位置，并形成转录复合物，引起组蛋白赖氨酸残基的去甲基化过程

3．5 二甲基化的组蛋白H3第四位赖氨酸(H3K4me2)的去甲基化过程引发了AR调控靶基因的转录过程

3．6 BER修复相关蛋白结合染色质相关区域并形成转录复合物，促进AR调控靶基因的转录

3．7 AR和众多辅助蛋白因子共同形成转录复合物，促进AR调控靶基因的表达

3．8 基因线环结构的形成促进转录复合物的形成，也就促进了AR调控靶基因的表达

第四部分 讨论

4．1 组蛋白H3赖氨酸残基的去甲基化过程的进一步研究

4．2 miR-125b2以及miR-133b预测的ARE靶位点的分析

4．3 8-oxo-dG进入BER修复途径的进一步分析

4．4 基因线环结构的形成以及它对AR调控靶基因转录的影响分析

4．5 表观遗传学影响AR调控靶基因转录过程相关的前列腺癌治疗

4．6 OGG1在细胞系中和癌症恶化的相关研究

参考文献

致谢

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