苯丙酸诺龙干预烫伤大鼠雄激素受体介导靶基因转录调控的实验研究

摘要

研究目的：探讨苯丙酸诺龙对雄激素受体介导靶基因转录调控的影响，进一步了解蛋白同化激素治疗烫伤的作用机制，为蛋白同化激素的临床应用与推广提供理论依据。 研究方法：采用随机对照实验，苯丙酸诺龙作为干预措施，对20％TBSA深Ⅱ°烫伤大鼠模型以及经RNA干扰后的培养大鼠肝细胞进行处理，从体内和体外两个方面，观测苯丙酸诺龙对大鼠不同组织细胞类固醇受体辅助活化因子1(SteroidReceptorCoactivator,SRC-1)及下游c-myc、IGF-1基因表达水平的影响。 1、体内实验：Wistar大鼠36只，采用随机数字表法，随机分为实验组、对照组与空白组，各12只，实验组与对照组制备成20％TBSA深Ⅱ°烫伤大鼠模型，实验组肌注苯丙酸诺龙5mg/kg，对照组用生理盐水代替，空白组不做任何处理。通过Genebank设计合成SRC-1、c-myc、IGF-1基因PCR引物上游F、引物下游R与TaqMan荧光探针。烫伤后21天全部大鼠断头处死，剪取肝脏、双侧睾丸、双侧卵巢组织约90mg±10mg，TrizolTM法提取总RNA，经逆转录后进行荧光定量PCR扩增，检测肝脏、睾丸、卵巢组织SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表达水平。 2、体外实验：通过Genebank设计合成大鼠肝细胞SRC-1的小干涉RNA片段(smallinterferingRNA，siRNA)共4对。采用重组DNA技术，双酶切质粒pSUPEREGFP1，将siRNA双链连接导入质粒pSUPEREGFP1，构建siRNA表达质粒载体，转化感受态大肠杆菌，经菌落PCR、双酶切验证、DNA测序筛选出阳性克隆，提取回收纯化阳性siRNA表达质粒载体。大鼠肝细胞株传代培养，将肝细胞按4对siRNA、脂质体、空白随机对照设计复孔种板，采用脂质体介导法转染肝细胞，进行RNA干扰(RNAi)，转染后12、24小时收集肝细胞，经荧光定量PCR从4对siRNA筛选出最佳RNA干扰效果的siRNA序列。再将培养大鼠肝细胞分为实验组(+NP+RNAi)、对照组(-NP+RNAi)、实验空白组(+NP-RNAi)、对照空白组(-NP-RNAi)共4组复6孔种板，使用筛选出的最佳siRNA质粒载体同样方法转染肝细胞，转染干扰后4小时按10μg/ml苯丙酸诺龙处理肝细胞，转染后24小时收集裂解肝细胞，以此为模板，逆转录后进行荧光定量PCR扩增，检测肝细胞SRC-1、c-myc、IGF-1基因的表达水平。 研究结果：1、体内实验结果表明，苯丙酸诺龙治疗20％TBSA深Ⅱ°烫伤大鼠模型前后，大鼠性腺(睾丸、卵巢)实验组与对照组SRC-1基因表达水平不同，肝脏、睾丸、卵巢组织实验组与对照组IGF-1基因的表达水平不同，两者P＜0.05，有统计学意义，提示苯丙酸诺龙能提高性腺SRC-1和肝脏、睾丸、卵巢IGF-1基因表达；而肝脏SRC-1基因，肝脏、睾丸、卵巢c-myc基因表达水平实验组与对照组组间差异不明显，P＞0.05，没有统计学意义，提示苯丙酸诺龙不能提高肝脏SRC-1和肝脏、睾丸、卵巢c-myc基因表达；实验组SRC-1基因表达水平与空白组肝脏、睾丸、卵巢三种不同组织SRC-1基因表达丰度之间存在相关关系，相关系数r=0.953，t检验P＜0.05，有统计学意义。 2、体外实验结果表明，RNA干扰与苯丙酸诺龙干预后，实验组与实验空白组，对照组与对照空白两组比较，肝细胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因表达水平均明显降低，P＜0.05，有统计学意义，提示RNA干扰SRC-1效果优良，SRC-1表达抑制后IGF-1、c-myc表达也被抑制而下降；实验组与对照组，实验空白组与对照空白组，大鼠肝细胞SRC-1、IGF-1、c-myc基因的表达水平相似，P＞0.05，没有统计学意义，提示苯丙酸诺龙在体外不能诱导提高SRC-1、IGF-1、c-myc基因表达，也不能逆转RNA干扰SRC-1后SRC-1、IGF-1、c-myc基因表达的下降。 研究结论：1.苯丙酸诺龙对性腺(睾丸和卵巢)通过细胞核内雄激素受体发挥作用需要SRC-1基因的正常表达，SRC-1的正常表达是IGF-1、c-myc正常表达的必要条件。 2.苯丙酸诺龙对肝脏SRC-1基因表达作用不明显，亦即苯丙酸诺龙的蛋白同化作用可能不是通过其干预调节SRC-1基因表达而完成雄激素受体活化转录调控，其原因有待进一步探讨。 3.苯丙酸诺龙可促进IGF-1基因的表达，串话IGF-1信号途径是苯丙酸诺龙的作用机制之一。 4苯丙酸诺龙对c-myc基因的表达没有协同诱导作用，其潜在致瘤的可能性较小，治疗剂量使用安全。

目录

声明

英汉对照表

本实验流程框图

前 言

材料与方法

第一部分体内实验

第二部分体外实验

一实验细胞

二主要试剂

三主要仪器与设备

四实验方法1

四实验方法2

结 果

讨论

结论

主要参考文献

文献综述

综述一蛋白同化激素及其应用

综述二蛋白同化激素的雄激素受体作用机制

综述三核受体辅助调节因子的研究

综述主要参考文献

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致 谢