焦磷酸测序技术检测慢性肾脏病患者Klotho基因启动子超甲基化的研究

摘要

第一部分焦磷酸测序技术检测慢性肾脏病患者Klotho基因启动子的超甲基化状态
　　背景: DNA甲基化是调节基因表达的一种表观遗传方式。焦磷酸测序技术是一种可进行准确定性和定量分析的DNA序列分析技术;Klotho在慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者和小鼠中呈现低表达，其机制尚不完全明了，Klotho基因启动子超甲基化在其中可能起一定作用。本研究旨在利用焦磷酸测序技术检测慢性肾脏病患者Klotho基因启动子甲基化状态。
　　方法: 2012年4月至2012年9月在复旦大学附属中山医院行肾脏活组织病理检查的CKD患者47例，取得患者同意并签署书面知情同意书。排除糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肝脏疾病、活动性感染、恶性肿瘤、吸烟、曾经使用过糖皮质激素或免疫抑制剂的患者。以47例同期于我院行肾癌根治术患者肾脏切除标本中的正常肾脏组织和48例健康志愿者的PBMC分别作为肾组织和PBMC的对照组。采用焦磷酸测序技术检测肾活检组织及外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC) Klotho基因启动子甲基化水平。
　　结果: 47例CKD患者男性24例，女性23例，年龄42.89±13.91岁，蛋白尿1.94(IQR0.85-3.48) g/24h，eGFR31.30(IQR13.59-60.52) ml/min/1.73m2;47例肾组织对照组男性25例，女性22例，年龄48.23±9.35岁，蛋白尿0.03(IQR0.00-0.19) g/24h，eGFR79.70(IQR70.74-101.35) ml/min/1.73m2;48例PBMC对照组男性24例，女性24例，年龄36.84±10.09岁，蛋白尿0.01(IQR0.00-0.10) g/24h，eGFR101.09(IQR91.55-115.34) ml/min/1.73m2。47例CKD患者肾组织标本中，36例(76.6％)Klotho基因启动子CpG岛呈现超甲基化，47例对照组肾组织标本中，Klotho基因启动子CpG岛未呈现超甲基化现象，CKD患者肾组织Klotho基因启动子甲基化率显著高于对照组(17.04±6.42 vs.9.34±2.43％，P＜0.001)。47例CKD患者PBMC标本中，28例(59.6％)Klotho基因启动子CpG岛呈现超甲基化，48例健康志愿者PBMC标本中，Klotho基因启动子CpG岛未呈现超甲基化现象，CKD患者PBMC Klotho基因启动子甲基化率显著高于健康志愿者(14.19±5.86 vs.6.90±2.39％，P＜0.001)。
　　结论: CKD患者的肾组织及PBMC Klotho基因甲基化率显著高于对照组，超甲基化可能是导致CKD患者体内Klotho低表达的机制之一。
　　第二部分慢性肾脏病患者外周血单核细胞Klotho基因启动子甲基化率对肾组织Klotho基因启动子超甲基化的评价作用
　　背景: 有研究显示肿瘤患者PBMC的基因甲基化水平可以作为肿瘤组织基因甲基化水平的生物标志物，但因检测方法、所检测的目标DNA片段及肿瘤类型不同而导致相关性不同。本研究旨在探讨慢性肾脏病患者外周血单核细胞Klotho基因启动子甲基化率对肾组织Klotho基因启动子超甲基化的评价作用。
　　方法: 2012年4月至2012年9月在复旦大学附属中山医院行肾脏活组织病理检查的CKD患者47例，取得患者同意并签署书面知情同意书。排除糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肝脏疾病、活动性感染、恶性肿瘤、吸烟、曾经使用过糖皮质激素或免疫抑制剂的患者。采用焦磷酸测序技术检测肾活检组织及PBMCKlotho基因启动子甲基化水平，并由两位病理医师对肾小管萎缩和间质纤维化占皮质肾组织面积的百分比进行评价。
　　结果: 47例CKD患者男性24例，女性23例，年龄42.89±13.91岁，蛋白尿1.94(IQR0.85-3.48) g/24h, eGFR31.30(IQR13.59-60.52) ml/min/1.73m2。 CKD患者PBMC与肾组织Klotho基因启动子甲基化率呈显著正相关(r=0.811，P＜0.001)，PBMC Klotho基因启动子甲基化率预测肾组织Klotho基因启动子超甲基化的受试者工作曲线下面积为0.958(P＜0.001)。CKD患者肾组织和PBMCKlotho基因启动子甲基化率与eGFR呈显著负相关(r=-0.827，P＜0.001;r=-0.626，P＜0.001)，与肾小管间质纤维化面积呈显著正相关(r=0.865，P＜0.001; r=0.748，P＜0.001)，与24小时尿蛋白无显著相关性。
　　结论: 慢性肾脏病患者PBMC与肾组织Klotho基因启动子甲基化率呈正相关，可作为肾组织Klotho基因启动子超甲基化的无创评价指标。Klotho基因启动子甲基化率升高与eGFR下降和肾小管间质纤维化面积增加相关，其在慢性肾脏病进展中的作用值得进一步研究。
　　第三部分 IgA肾病患者外周血单核细胞Klotho基因启动子甲基化率与临床病理特征的关系
　　背景: IgA肾病是最常见的原发性慢性肾小球肾炎，我们的前期研究发现慢性肾脏病患者PBMC Klotho基因启动子甲基化率显著升高，且与肾组织Klotho基因启动子甲基化率呈正相关，可作为肾组织Klotho基因启动子超甲基化的无创评价指标。本研究主要探讨IgA肾病患者PBMC的Klotho基因启动子甲基化率与其临床病理特征的关系。
　　方法: 2012年8月～2013年2月在复旦大学附属中山医院肾内科病房住院治疗并于住院期间行肾脏活组织病理检查，术后病理证实为原发性IgA肾病的临床和病理资料完整的患者，取得患者知情同意。采用焦磷酸测序法检测患者PBMCKlotho基因启动子的甲基化率，肾小球、肾小管及血管的各项病理参数的半定量积分采用Katafuchi评分标准，分析PBMC Klotho基因启动子的甲基化率与IgA肾病的临床病理特征的关系。
　　结果: 86例IgA肾病患者男女比为男性35例，女性51例，年龄35.77±11.03岁，eGFR86.41 ml/min/1.73 m2(IQR66.85-104.34ml/min/1.73m2).eGFR≥60ml/min/1.73m2组的PBMC Klotho启动子甲基化率显著低于eGFR＜60ml/min/1.73m2组(5.38±1.42％ vs.6.46±1.98％，P＜0.05)。经单因素相关分析，IgA肾病患者eGFR与男性(p=-0.216，P＜0.05)、年龄(r=-0.469，P＜0.001)、平均动脉压(r=-0.331，P＜0.01)、PBMC Klotho甲基化率(r=-0.281，P＜0.01)呈显著负相关。进一步对男性、年龄、平均动脉压、PBMC Klotho启动子甲基化率进行多元回归分析，发现eGFR与年龄(P＜0.01)、PBMC Klotho启动子甲基化率(P＜0.05)呈负相关，与男性、平均动脉压无相关性。IgA肾病患者PBMC Klotho启动子甲基化率与间质纤维化积分呈正相关(p=0.273，P＜0.05)，与肾小球增殖程度积分、节段损害积分、球性硬化积分、间质炎性细胞浸润积分、肾小管萎缩积分、血管壁增厚积分和血管玻璃样变性积分等肾脏病理指标无相关性。
　　结论: PBMC Klotho基因启动子甲基化率升高是IgA肾病患者eGFR下降的独立危险因素，PBMC Klotho基因启动子甲基化率升高与IgA肾病患者的肾间质纤维化加重相关，PBMC Klotho基因启动子甲基化率越高，肾间质纤维化越严重。

目录

英文缩写词表

摘要

前言

参考文献

第一部分 焦磷酸测序技术检测慢性肾脏病患者Klotho基因启动子的超甲基化状态

引言

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 慢性肾脏病患者外周血单个核细胞Klotho基因启动子甲基化率对肾组织Klotho基因启动子超甲基化的评价作用

引言

对象和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 IgA肾病患者外周血单个核细胞Klotho基因启动子甲基化率与临床病理特征的关系

引言

对象和方法

结果

讨论

参考文献

论文小结

综述 DNA甲基化检测方法研究进展

一、硕士期间参加科研项目情况

二、硕士期间论文发表情况

致谢

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