应用焦磷酸测序技术行HPV分型检测及HPV16甲基化状态与宫颈致癌作用研究

摘要

一、焦磷酸测序技术行宫颈脱落细胞Hr-HPV（高危型HPV）分型检测
　　 目的：评价焦磷酸测序技术在Hr-HPV分型检测中的应用价值，分析此方法的准确性、检出高级别宫颈病变的有效性，及应用于临床检查和大规模筛查的可行性。同时获取以阴道镜门诊患者为研究人群的Hr-HPV感染比例及所感染病毒型别的分布。
　　 内容：以200名阴道镜门诊患者为研究对象，所有患者均接受宫颈液基细胞学检查（TCT）、HC-Ⅱ检测、焦磷酸测序Hr-HPV分型检查。评估焦磷酸测序技术在宫颈Hr-HPV检测中的应用价值；分析焦磷酸测序Hr-HPV检查结果与HC-Ⅱ检测的一致性；评价焦磷酸测序技术检出宫颈高级别病变（CINⅡ及以上病变）的价值；分析研究人群中Hr-HPV型别分布。
　　 方法：应用焦磷酸测序法检测12型Hr-HPV（包括HPV16，18，31,33，35，39，45，51，52，56，58和59）感染。自宫颈液基细胞学检查剩余细胞中提取DNA，经HPV通用型引物扩增后，行焦磷酸测序检测以上12型Hr-HPV，其中每四种型别测序引物至于同一反应池中，仅需10分钟即可完成测序反应。分析此种检测技术与美国FDA唯一认证的HPV临床检测手段-HC-Ⅱ方法检测出Hr-HPV感染的一致性；评价其作为宫颈癌及宫颈癌前病变筛查手段的有效性；根据测序结果确定标本中特异型别的Hr-HPV感染，了解研究人群中Hr-HPV感染的型别分布。并将通用型引物PCR阳性而焦磷酸测序阴性标本的PCR产物纯化、克隆后行传统测序分型检测，确定所感染的HPV型别。
　　 结果：经焦磷酸测序检测，发现200例研究对象中Hr-HPV感染98例，其中单一感染88例，双重感染10例，检测出9种Hr-HPV感染（HPV16，HPV18，HPV31，HPV33，HPV39，HPV45，HPV52，HPV58和HPV59）。Hr-HPV感染中，HPV16感染率为69.4％，占第一位；HPV-58感染率为16.3％，占第二位。焦磷酸测序检测出的Hr-HPV感染率与宫颈病变呈正相关关系（Kendall值为0.704，P<0.001）；此方法检出高级别宫颈疾患的敏感性和特异性分别为95％和65.1％，ROC曲线下面积为0.80；焦磷酸测序检测Hr-HPV与HC-Ⅱ方法有高度的一致性（Kappa值为0.791，P<0.001）。
　　 结论：焦磷酸测序检测技术应用于Hr-HPV检测与HC-Ⅱ方法有很好地一致性，并可以进行HPV分型检测。其对宫颈CINⅡ及以上病变具有很好的检出率。是宫颈癌及癌前病变筛查的有效手段。
　　 二、应用焦磷酸测序技术对HPV16 L1片段3’端和LCR上CpG位点甲基化水平行定位、定量检测并分析与HPV16致宫颈癌作用相关性
　　 目的：应用焦磷酸测序技术定位、定量检测位于HPV16 L1片段3’端和LCR上的21个甲基化位点的甲基化率，分析比较无宫颈病变携带者、CIN患者和宫颈癌患者间各甲基化位点甲基化率差异，了解HPV16甲基化与其致病性的关系。
　　 内容：以HPV16阳性的无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者各30例为研究对象，研究各组患者所感染HPV16病毒L1片段3’端和LCR片段甲基化位点的甲基化状念，分析评价HPV16甲基化与其致病性间关系。
　　 方法：选择HPV16阳性的无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者各30例，使用宫颈液基细胞学检查剩余细胞提取DNA，经重亚硫酸盐处理后，分7个片段扩增HPV16 L1片段3’端和LCR区域（此区域包含E6/E7启动子增强子及E2结合位点），应用焦磷酸检测技术经测序分析检测研究片段所涉及的21个CpG位点甲基化状态，比较每一个甲基化位点甲基化率在三组患者间是否存在差异，评价HPV16甲基化与其致病性间的关系。
　　 结果：经定位、定量检测HPV16目的片段上21个CpG位点甲基化水平，发现位于E6/E7启动子的5个甲基化位点均存在随病情进展甲基化率逐渐减低趋势，在无宫颈病变病毒携带者、CIN患者和宫颈癌患者三组间存在显著性差异。位于L1片段3’端7032，7019，7136三个位点的甲基化率在三组间存在显著性差异，7032和7019位点无病变携带者甲基化率最低，宫颈癌者甲基化率最高，7136位点CIN组甲基化率最高，宫颈癌组次之，无病变者最低。
　　 结论：HPV16 L1片段3’端及E6/E7启动子CpG位点甲基化率在三组患者中存在显著性差异，这种甲基化差异可促进HPV16与宿主基因整合、E6/E7癌基因表达从而导致宫颈癌的发生。HPV16甲基化状况可能成为鉴别HPV16自愈性或致病性感染的手段，预测宫颈癌前病变及宫颈癌的发生，并且可能能够为进一步的治疗提供新的靶点。