用于耐药性肿瘤治疗的药物——Pluronic键合物混合胶束系统的研究

摘要

肿瘤的多药耐药性(Multidrug resistance，MDR)是临床上化疗失败的主要原因之一。迄今，许多抗肿瘤药物如紫杉烷类、长春碱类和蒽醌类等，在临床上都出现了多药耐药性。目前，开发具有逆转MDR活性的Pluronic胶束递药系统成为治疗耐药性肿瘤的一种新思路。但普通胶束的载药量低，对耐药肿瘤的体内作用仍不理想。
　　本课题首先选用极易耐药的甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)为模型药物，构建了以药物-载体键合物(Polymer-drug conjugates)方式载药的混合胶束(Chemicalconjugation of drug in mixed micelles)，使胶束的载药量和体内外抗MDR肿瘤药效明显提高。在研究中发现，可以直接将亲水性药物键合于胶束的载体材料上，同时胶束的疏水内核还可以包载难溶性药物，通过两种载药方式结合可以实现水溶性和疏水性药物的联合给药，进一步提高胶束载药量，发挥药物协同作用的优势。为进一步验证这一构想，选用临床常用的联用药物阿霉素(doxorubicin，DOX)和紫杉醇(paclitaxel，PTX)为模型药物，构建双载药混合胶束系统;并将高靶向性的c(RGDyK)肽修饰在混合胶束中F127的PEO链上，通过肿瘤新生血管内皮细胞和MDR肿瘤细胞高表达的整合素αvβ3受体介导，增加药物在肿瘤部位的渗透和蓄积能力，抑制肿瘤新生血管的生成，提高对耐药肿瘤的治疗作用。
　　本文第一部分中，合成了MTX与Pluronic P105的键合物P105-MTX，并与F127制备混合胶束F127/P105-MTX;以及Pluronic P105/F127物理包载MTX的混合胶束PF-MTX，并以胶束的载药量，包封率和粒径为考察指标，筛选出了PF-MTX的较优处方。结果显示，PF-MTX的较优处方为P105、F127和MTX的比例为266.7 mg∶33.3 mg∶10 mg，制备的PF-MTX粒径为22 nm;F127/P105-MTX的载药量为PF-MTX的3.3倍，粒径增大，约为100 nm，形态圆整，大小均一。DSC分析表明MTX以无定形分子或固态溶液形式分散在共聚物骨架中;F127/P105-MTX比PF-MTX具有更强的缓释作用，pH5.0条件下比pH7.4更有利于MTX的释放。Pluronic P105/F127混合胶束具有良好的生物相容性和明显的MDR肿瘤的治疗作用，主要由网格蛋白和陷穴小泡介导的两种内吞途径入胞后，通过溶酶体转运，需要能量;对于耐长春新碱人口腔上皮癌细胞(KBv)，F127/P105-MTX比PF-MTX显示出更强的药效。
　　本文第二部分中，以KBv为MDR细胞模型，对F127/P105-MTX的作用机理进行研究，通过A-549和KBv细胞摄取与摄取抑制实验表明，F127/P105-MTX具有叶酸受体的亲和性，并且游离叶酸的存在对其摄取具有竞争性作用;体外3D肿瘤球实验显示F127/P105-MTX比PF-MTX具有更强的MDR实体肿瘤渗透能力和抑制肿瘤球生长的能力;大鼠体内药动学结果表明，F127/P105-MTX的AUC0→t是PF-MTX组的2.43倍;体内平均滞留时间(MRT)是PF-MTX组的1.34倍;清除率(CL)相对于PF组均显著降低，比物理载药胶束延长了药物的体内循环时间;小动物活体成像实验证明F127/P105-MTX明显增加了胶束在体内肿瘤部位的蓄积;药效学实验表明，F127/P105-MTX比PF-MTX显示出更显著的抑制MDR肿瘤的生长的作用，且安全性良好。进一步证实了键合方式载药胶束用于体内治疗耐药肿瘤具有可行性。
　　本文第三部分中，选择了临床上常用于联合给药治疗乳腺癌的两种药物DOX与PTX为模型药物，将DOX键合于Pluronic P105两端，并与F127包载PTX制备得到双载药混合胶束PF-DP。以载药量、包封率和细胞毒性为指标进行筛选，得到载体∶DOX∶PTX的最优比例为300 mg∶4 mg∶6mg; PF-DP总载药量为2.5％，粒径为25 nm，具有缓释作用，pH5.0比中性条件下更有利于药物的释放。采用人乳腺癌细胞(Michigan Cancer Foundation-7，MCF-7)及其耐药株(MCF-7/ADR)为细胞模型进行体外研究。细胞摄取和细胞器共定位结果表明，通过胶束联合给药显著增加耐药细胞内DOX和PTX的蓄积量，有利于发挥协同作用;这个过程需要能量，靠网格蛋白和陷穴小泡介导，受溶酶体酸性影响。细胞周期、细胞凋亡、细胞毒性和3D肿瘤球实验结果表明，DOX与PTX联合给药对于敏感和耐药肿瘤细胞都显示出协同作用，PF-DP对于耐药肿瘤细胞的毒性显著强于游离混合药物(DOX+PTX)。
　　本文第四部分中，采用与肿瘤细胞和新生血管细胞高表达的整合素αvβ3特异性识别并结合的c(RGDyK)为靶向头基，表面修饰PF-DP，构建c(RGDyK)修饰的双载药混合胶束递药系统(c(RGDyK)-FP-DP)。理化性质表征显示，该靶向混合胶束与PF-DP相比，粒径、ζ电位、载药量和包封率以及体外的释放行为均没有发生显著变化。以整合素αvβ3受体蛋白高表达的人脐静脉内皮细胞(Humanumbilical vein endothelial cells，HUVEC)为新生血管模型，考察c(RGDyK)-FP-DP的体外抗血管生成作用。结果表明，靶向混合胶束显著增加HUVEC的摄取，这个过程是通过整合素受体介导的，需要能量，穿过HUVEC单层细胞后，可渗透入耐药肿瘤球较深部位;靶向混合胶束对HUVEC细胞毒性较低，具有抑制微管形成的作用。c(RGDyK)-FP-DP混合胶束对KBv耐药细胞显示出高的细胞毒性，增加了细胞摄取;在体内外显示出明显的KBv肿瘤靶向性。
　　本文第五部分中，以荷KBv皮下瘤裸鼠为模型，对双载药混合胶束的组织分布和体内药效学进行考察。结果显示，混合胶束明显改变了药物在各主要组织器官的分布，减少了药物在心、肝和脾等正常组织的分布，增加了肿瘤部位的蓄积和血液中的循环时间。通过c(RGDyK)的修饰，进一步增加了肿瘤组织的药物量。药效学实验表明，c(RGDyK)-FP-DP具有明显抑制MDR肿瘤生长的作用，显著延长了荷瘤鼠的生存期，降低了药物的毒副作用，证实了c(RGDyK)-FP-DP在体内亦有的良好的肿瘤组织和新生血管的主动靶向性和有效治疗MDR肿瘤的双重效应。本研究可为耐药肿瘤的靶向治疗提供一定的参考和实验依据。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 甲氨蝶呤-Pluronic键合物混合胶束的构建与体外评价

第一节 MTX-Pluronic键合物混合胶束的制备与表征

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 不同载药方式的甲氨蝶呤混合胶束细胞水平评价

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 甲氨蝶呤-Pluronic键合物混合胶束治疗耐药肿瘤的机理研究和体内外评价

第一节 F127／P105-MTX对KBv耐药肿瘤的亲和性研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 F127／P105-MTX的体内药动学和药效学研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章 双载药混合胶束治疗多药耐药肿瘤的研究

第一节 同时载紫杉醇和阿霉素的Pluronic P105／F127双载药混合胶束的构建和表征

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 同时包载紫杉醇和阿霉素的Pluronie P105／F127混合胶束的体外研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第四章 整合素受体介导的双载药混合胶束系统的构建及靶向性评价

第一节 RGD环肽修饰的双载药混合胶束的构建和表征

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 c(RGDyK)-FP-DP体外抗血管生成作用的研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第三节 c(RGDyK)-FP-DP治疗KBv耐药肿瘤的研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第五章 双载药混合胶束治疗耐药肿瘤的体内研究

第一节 整合素受体介导的双载药混合胶束的组织分布研究

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

第二节 双载药混合胶束的体内药效学和安全性初步评价

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 小结

参考文献

全文总结

课题创新性研究

后续工作及展望

中英文缩写对照

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在校期间申请专利

在校期间发表会议论文

在校期间获奖情况

致谢

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