多烯紫杉醇Pluronic P105/F127混合胶束用于治疗多药耐药肿瘤的研究

摘要

肿瘤的多药耐药是(Multidrug resistance，MDR)是当今肿瘤化疗的一大障碍，也是多数肿瘤患者化疗失败，预后不佳的主要原因。迄今，许多抗肿瘤药物在临床上都出现了多药耐药性。由于Pluronic具有既增溶药物，又能实现逆转肿瘤MDR的效果，本文构建了新型的Pluronic混合胶束系统—NGR多肽修饰的Pluronic P105/F127混合胶束，除增溶疏水性的抗肿瘤药物多烯紫杉醇，逆转肿瘤MDR的作用外，期望通过存在于肿瘤新生血管上的CD13受体介导该系统进入肿瘤细胞，以期进一步提高对多药耐药肿瘤的治疗效果。为探索逆转肿瘤多药耐药性的载体给药途径提供实验依据和理论基础。
　　本文第一章通过Pluronic P105和F127为材料采用薄膜水化法制备了载多烯紫杉醇的混合胶束(PF-DTX)。以ER％、DL％和DTX pre％为考察指标，在单因素考察的基础上，应用星点设计设计进行优化，得到较优处方与制备工艺。制备得到的PF-DTX包封率为92.40％，载药量为1.81％。制备得到的PF-DTX粒径约为23nm，且单峰分布，外观呈圆球状;Pluronic P105/F127(75.92∶24.08，w/w)的CMC为0.0056％(w/v);PF-DTX在体外具有缓释效应，在4℃下贮存可保持6个月的稳定性。
　　第二章为了进一步考察PF-DTX在逆转多药耐药肿瘤前景，以紫杉醇耐药株细胞(A549/Taxol)为多药耐药细胞模型，评价了载多烯紫杉醇Pluronic P105/F127混合胶束(PF-DTX)在体外逆转肿瘤MDR的能力。CCK8法测定PF-DTX对A549细胞的抑制效果与Taxotere无显著性差异;而PF-DTX对A549/Taxol细胞的IC50值显著低于Taxotere组。细胞摄取实验结果显示，在Pluronic P105/F127的存在下，A549/Taxol对罗丹明123(R123)和DTX的摄取均显著增加(p＜0.01)。线粒体膜电势测定表明，在Pluronic存在下，细胞内线粒体膜电位降低。细胞凋亡与周期测定结果显示，与Taoxtere相比，PF-DTX处理的A549/Taxol细胞处于早期凋亡以及晚期凋亡的细胞均显著增多(p＜0.05)，对A549/Taxol细胞在G2/M期的捕获能力显著增强。上述结果表明，Pluronic P105/F127可与DTX协同作用，增加DTX的入胞量，故具有一定逆转肿瘤MDR的能力。
　　第三章首先合成了羧基化Pluronic F127，通过采用DCC和NHS活化羧基生成F127-NHS，并进一步将NGR小分子肽通过酰胺键接枝到F127端形成功能化的NGR-F127。构建的NGR-PF-DTX靶向递药系统粒径约为25nm，所测得的ζ电位为-13.77±1.30mv;载药量、包封率以及体外释放行为与普通胶束相比均没有显著变化。细胞毒性结果显示，NGR-PF-DTX对HUVEC的IC50值为8.03ng/ml，显著小于PF-DTX组(p＜0.01)。荧光显微镜观察细胞摄取，结果表明HUVEC细胞摄取NGR修饰的胶束绿色荧光强度显著强于普通胶束。加入NGR多肽后细胞摄取NGR胶束的绿色荧光有所减弱。流式定量结果显示NGR胶束组的平均荧光强度与普通胶束组相比有显著性差异(p＜0.01);加入竞争抑制剂NGR多肽后摄取NGR胶束的荧光强度显著减弱(p＜0.05)。采用活体成像技术考察胶束在荷瘤小鼠体内的分布，结果证明了NGR的修饰有利于胶束体系通过肿瘤新生血管富集于肿瘤靶部位，增加对实体瘤靶向性。药动学结果显示胶束制剂能够明显提高DTX的体内循环时间，AUC值与MRT值均显著高于市售制剂组(p＜0.05)，表明胶束制剂可以利用肿瘤的EPR效应提高药物在肿瘤靶部位的浓度。通过测定给药后肿瘤体积大小，评价了各组制剂的药效，结果表明Taxotere组肿瘤重量与生理盐水组相比无显著性差异，而PF-DTX组的肿瘤重量显著低于Taxotere组(p＜0.05)，其抑瘤率(69.05％)约为Taxotere组(34.42％)的2倍;NGR-PF-DTX组表现出更明显的肿瘤治疗效果，抑瘤率(82.95％)约为Taxotere组其他的2.4倍，其肿瘤重量显著低于PF-DTX组(p＜0.05)。综上表明，PF-DTX的抗MDR肿瘤效果显著优于Taxotere组，而且NGR修饰的主动靶向胶束治疗多药耐药肿瘤效果更为明显。
　　第四章对构建的胶束体系在健康BALB/c小鼠体内进行了毒性的初步评价。病理学切片观察、血液学检查和肝肾功能检查等初步评价结果显示普通胶束以及NGR靶向胶束均未显示明显的体内毒副性，我们认为Pluronic P105/F127以及NGR修饰的靶向胶束材料可能是安全的载体。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 载多烯紫杉醇Pluronic P105／F127混合胶束的制备与理化性质的表征

第一节：PF-DTX的制备与优化

1 试剂和仪器

2 实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

第二节 混合胶束的体外表征

1．仪器和材料

2 实验方法

3 实验结果

4．讨论

5．小结

参考文献

第二章 载多烯紫杉醇Pluronic P105／F127混合胶束用于治疗多药耐药肿瘤的体外评价

1．仪器与试剂

1．1 仪器

1．2 试剂

2 实验方法

2．1 细胞培养

2．2 细胞毒作用

2．3 Pluronic P105／F127对R-123和DTX在MDR细胞摄取的影响

2．4 细胞凋亡检测

2．5 线粒体膜电势(△ψ)的测定

2．7 细胞周期检测

3．实验结果

3．1 细胞毒

3．2 摄取影响

3．3 线粒体膜电势的测定

3．4 细胞凋亡

3．5 细胞周期

4 讨论

5．小结

参考文献

第三章 NGR修饰PF-DTX胶束构建及体内外研究

第一节：NGR-PF-DTX构建与表征

1 试剂与仪器

2 实验方法

3．实验结果

4．讨论

5．小结

第二节：NGR-PF-DTX的体内外靶向性评价

1 试剂和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4．讨论

5．小结

第三节：NGR-PF-DTX体内药动学及药效评价

1 试剂和仪器

2 实验方法

3．实验结果及讨论

4．小结

参考文献

第四章 混合胶束体内毒性初步评价

1 试剂与仪器

1．1 试剂

1．2 仪器

1．3 动物

2 实验方法

2．1 器官组织病理学切片评价

2．2 混合胶束的血液学评价

2．3 混合胶束的肝肾毒性评价

3 结果

3．1 器官组织病理学切片评价

3．2 血液学评价

3．3 肝肾毒性评价

4 小结

参考文献

全文总结

在校期间所取得的成果

致谢

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