大剂量地塞米松改善免疫性血小板减少症患者CD5+B细胞免疫调节功能的研究

摘要

背景:免疫性血小板减少症(ITP)由自身免疫机制介导，是血液系统常见的出血性疾病。多数患者体内可以检测到抗血小板膜糖蛋白(GP)的自身抗体，导致血小板破坏加速和/或巨核细胞生成血小板功能障碍。B细胞由于其分泌抗体的特性，长期以来在ITP中一直被认为是重要的致病性因素。但近年来的研究表明，B细胞中存在着部分亚群可以负向调节免疫反应，称为调节性B细胞(Bregs)，主要通过分泌IL-10发挥免疫调节效应。CD5是Bregs的重要表面标志之一，CD5+B细胞可以产生大量IL-10，因此CD5+B细胞在ITP免疫失衡机制及疾病发生发展中的作用不容忽视。大剂量地塞米松(HD-DXM)作为ITP治疗的一线方案之一，广泛作用于多种免疫细胞，如纠正Th1/Th2失衡、抑制树突状细胞成熟、减少促炎性细胞因子合成等，但其如何影响Bregs尤其是CD5+B细胞的免疫调节功能尚未阐明。
　　目的:首先通过研究ITP患者外周血CD5+B细胞产生及分泌IL-10能力、对效应性T细胞的增殖、凋亡及Th1/Th2平衡的调控作用等，阐明ITP患者CD5+B细胞的免疫调节功能缺陷;然后比较HD-DXM治疗前后ITP患者CD5+B细胞上述功能的变化，揭示HD-DXM改善CD5+B细胞免疫调节功能的作用，从而帮助我们认识CD5+B细胞在ITP发病机制中的作用，并进一步从B细胞免疫调节功能角度加深对HD-DXM作用机制的理解;最后在TLRs信号传导通路中初步鉴定出可能导致ITP患者CD5+B细胞免疫调节功能障碍的分子缺陷。
　　方法:（一）采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各2mL，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单形核细胞(PBMCs); PE-CD5/FITC-CD19流式抗体标记，流式细胞术检测CD5+CD19+B细胞的数量;在佛波酯(PMA)、离子霉素及布雷菲尔德菌素A(BFA)刺激条件下体外培养24小时后收获细胞，表面标记PE-CD5/FITC-CD19，固定、破膜后标记APC-IL-10，流式细胞术检测各细胞亚群胞内IL-10平均荧光强度及IL-10+细胞比例;留取部分标本以荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测IL-10 mRNA表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆和培养上清液IL-10浓度。
　　(二）采集符合纳入标准的初发ITP患者接受HD-DXM治疗前后及健康志愿者静脉血各20mL，分离PBMCs，免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞、CD5-CD19+B细胞和CD4+T细胞，CFSE标记CD4+T细胞，接种于预包被CD3mAb和CD28 mAb的96孔培养板，以不同梯度比例与CD5+CD19+B细胞或CD5-CD19+B细胞共培养3～6天后，流式细胞术检测CD4+T细胞增殖状态;细胞标记PI/Annexin-Ⅴ以检测其凋亡状态;细胞培养上清液以ELISA方法检测IL-4及IFN-γ的浓度;RT-PCR法检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达。
　　（三）采集初发ITP患者及健康志愿者静脉血各20mL，分离PBMCs，免疫磁珠方法分别纯化出CD5+CD19+B细胞，运用PCR Array的方法，分析ITP患者CD5+B细胞中TLRs及其下游信号传导通路异常表达的分子。
　　结果:（一）ITP患者外周血CD5+B细胞占淋巴细胞的比例及绝对值计数均显著高于正常人，而且胞内IL-10染色表明ITP患者CD5+B细胞表达更高的IL-10平均荧光强度;RT-PCR结果提示ITP患者IL-10mRNA表达亦高于正常对照。但在体外培养上清液中，ITP患者的IL-10浓度明显低于正常对照。在经过HD-DXM有效治疗的患者，外周血CD5+B细胞数量恢复正常，其胞内IL-10表达进一步加强，IL-10 mRNA仍维持在较高水平，而培养上清液中IL-10的浓度则与正常相当。
　　（二）当CD5+B细胞与CD4+T细胞共培养时，正常对照来源的CD5+B细胞可以抑制CD4+T细胞的增殖，并呈现剂量依赖效应。同时，CD5+B可促进CD4+T细胞的凋亡。与此相反，CD5-B细胞并不能抑制CD4+T细胞增殖，反而在体外培养72小时后，CD4+T细胞的增殖轻度增加，但这种差异尚不具有统计学意义。CD5-B细胞对CD4+T细胞的凋亡无明显影响。在ITP患者中，CD5+B细胞的免疫调节功能明显受损。CD5+B细胞与CD4+细胞的比例增加至3∶1时方才显现出对CD4+T细胞增殖的抑制作用。ITP患者CD5+B细胞促进CD4+T细胞凋亡的能力亦存在缺陷。接受HD-DXM治疗后，CD5+B细胞抑制CD4+T细胞增殖的能力增强，促进凋亡的能力也可恢复至与正常相当。
　　在健康对照中，在B∶T细胞的比例仅为1∶5时，CD5+B细胞即可明显抑制CD4+T分泌IFN-γ。 ITP患者的CD5+B细胞抑制IFN-γ分泌的能力明显受损:只有当B/T比例升至1∶1时，IFN-γ的分泌才有所下降;而且，即使在B/T比例达到5∶1时，ITP患者的CD4+T细胞仍可保留大约30％的IFN-γ分泌。CD5+B细胞对IL-4的分泌无明显影响。接受HD-DXM治疗后，CD5+B细胞抑制IFN-γ分泌的的能力得到部分恢复，但未能达到正常水平。
　　（三）共有20个TLRs信号通路相关分子在ITP和正常对照之间表达明显相异。在ITP组中高表达的分子有12个，分别为CLEC4E、F0S、IL1B、IL6、IL8、IRAK1、JUN、PTGS2、SIGIRR、TICAM2、TLR2和TNF。低表达的为8个，分别为CSF2、CSF3、IFNB1、IRF3、TLR10、TLR3、TLR7和TLR9。
　　结论:ITP患者外周血CD5+B细胞数量增多，其胞内可产生大量IL-10，由于IL-10分泌障碍导致IL-10积聚于胞内，进而影响CD5+B细胞抑制T细胞增殖和纠正Th1/Th2失衡的能力;经HD-DXM有效治疗后，CD5+B细胞数量和功能均可恢复至正常，抑制CD4+T细胞增殖的能力均可恢复，但其抑制CD4+T细胞分泌IFN-γ的功能则仅部分恢复。TLRs信号通路相关分子表达异常可能是导致ITP患者CD5+B细胞数量和功能异常的潜在机制。

目录

英文缩略词表

摘要

第一部分 HD-DXM改善ITP患者外周血CD5+B细胞IL-10分泌障碍

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第二部分 HD-DXM治疗改善ITP患者CD5+B细胞对T细胞亚群的免疫调节功能

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

参考文献

第三部分 ITP患者CD5+B细胞免疫调节功能缺陷的机制初探

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

参考文献

结论

Review Pulsed high-dose dexamethasone treatment for immune thrombocytopenia：from clinical to mecnanistic perspectives

综述 调节性B细胞及其在血液系统疾病中的研究进展

博士在读期间论文发表

博士在读期间课题申请及立项

致谢

声明