铜绿假单胞菌甲醛脱氢酶的分子伴侣共表达、纯化及酶活检测

摘要

甲醛脱氢酶(FDH)作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一广泛存在于原核和真核生物中。该酶能利用NAD+作为辅酶，将有毒的甲醛氧化。目前发现除了恶臭假单胞菌甲醛脱氢酶外，其余的甲醛脱氢酶均需要谷胱甘肽参与甲醛的氧化过程。为了能对其他物种谷胱甘肽非依赖性甲醛脱氢酶进行结构和功能研究，需要建立大肠杆菌表达体系实现具有生物酶活性的甲醛脱氢酶的可溶性表达和高度纯化。
　　铜绿假单胞菌（即绿脓杆菌，Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性致病菌，可引起人体感染。该菌的FDH与恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) FDH具有高度序列相似性。本研究通过分子克隆技术构建铜绿假单胞菌甲醛脱氢酶基因表达载体，利用共表达技术，通过分子伴侣GroES、GroEL和Tig与甲醛脱氢酶在大肠杆菌中共表达，减少了重组蛋白包涵体的形成，显著提高了可溶性铜绿假单胞菌FDH在大肠杆菌中的表达水平。
　　通过三步色谱柱分离纯化方法，可从1L培养产物中得到约3.2mg的高纯FDH重组蛋白。质谱分析、蛋白质晶体结构解析以及酶活动力学实验均证明了铜绿假单胞菌FDH蛋白在分子伴侣共表达作用下，在大肠杆菌中能够进行正确折叠，形成了具有生物学活性的重组蛋白。

目录

摘要

前言

第一章 铜绿假单胞菌FDH表达载体构建

第一节 基因序列选择

第二节 表达载体的选择

第三节 实验材料与方法

第四节 实验结果

第二章 铜绿假单胞菌FDH基因的大肠杆菌表达

第一节 分子伴侣

第二节 表达宿主菌的选择

第三节 实验材料和方法

第四节 实验结果

第三章 铜绿假单胞菌甲醛脱氢酶蛋白的纯化

第一节 实验材料和方法

第二节 实验结果

第四章 铜绿假单胞菌FDH的质谱分析和蛋白结晶

第一节 蛋白质谱分析

第二节 蛋白结晶技术

第三节 实验材料和方法

第四节 实验结果

第五章 铜绿假单胞菌FDH的酶活性检测

第一节 酶活测定

第二节 实验材料和方法

第三节 实验结果

结论

参考文献

致谢

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