新型小鼠心血管病理生理平台建立及奥美沙坦通过激活DLL4/Notch1缓解压力超负荷小鼠心脏重构

摘要

在当今的心血管基础研究中，小鼠已经成为常规动物模型。国外各大知名心血管研究机构大多设有专门的小鼠心血管病理生理平台，为相关课题组提供优质而稳定的小鼠模型、评价指标和病理生理学数据。在此背景下，国内的一些大型研究机构也开始建设小鼠心血管病理生理平台。我们在此前已有的平台雏形基础上，在国内率先引进小鼠多普勒冠状动脉血流显影技术和主动脉瓣返流模型，力图建成一个世界领先的，整合造模（包括心肌梗死、主动脉缩窄、主动脉瓣返流等主要小鼠心血管疾病手术模型）、影像、血流动力学的综合性小鼠心血管病理生理平台。
　　已有报道称Notch信号通路通过调节心脏对应激的适应性，起到对受损心肌的保护作用，促进心肌存活和心肌前体细胞增殖和分化，改善心脏重构和心脏功能。该信号通路的激活对于受损心肌组织的存活和再生必不可少，调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡和再生等过程。而当其受到抑制时，心脏肥大、心肌纤维化、凋亡和心功能不全将进一步恶化。利用我们实验室现有的小鼠心血管病理生理平台，在实验室先前研究成果的基础之上进一步拓展，我们使用主动脉缩窄所致的心脏压力超负荷小鼠模型，验证了一种广泛使用的血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂奥美沙坦，能通过激活DLL4/Notch1信号通路延缓压力超负荷小鼠的心脏重构和心功能失代偿。
　　第一部分 新型小鼠心血管病理生理平台建立
　　一、超声冠状动脉血流灌注对心肌梗死小鼠梗死面积的无创性评估
　　背景和目的:
　　小鼠心肌梗死模型越来越广泛地被应用在分析心肌梗死发病机制和观察治疗手段疗效上。虽然这一模型在心血管基础研究中的地位显赫，但要精确评估小鼠冠状动脉左前降支结扎的效果，除了通过取材观察大体标本和进行病理切片染色之外，尚无较为简便而有效的无创性评估方法。我们因此探讨通过冠状动脉多普勒血流显像，比较冠状动脉左前降支结扎术前及术后早期（1天）冠状动脉左前降支血流灌注的变化，从而探讨无创性评价梗死面积的可行性。
　　方法:
　　对冠状动脉左前降支结扎的C57BL6/J小鼠，通过经胸超声心动图，测量左心室结构、心功能和冠状动脉左前降支血流灌注，同时行心电图、血清肌钙蛋白Ⅰ(troponinⅠ，TnⅠ)检测。通过2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色，确认梗死面积。
　　结果:
　　在所有观测指标中，术后冠状动脉充血态舒张期血流速度峰值(peakdiastolic velocity，PDV)、冠状动脉血流储备(coronary flow reserve，CFR)与梗死面积相关性最好（R2分别为0.8028和0.5825，P＜0.0001）。以梗死面积≥30％视为冠状动脉左前降支结扎成功(MI+)，＜30％视为结扎失败（MI-），受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析显示，术后冠状动脉充血态PDV和CFR最为有效地估测心肌梗死面积，参考值分别为480.16 mm/s和1.89。进一步发现，在冠状动脉充血态PDV和CFR明显受损的小鼠中，心功能受损、左心室内径明显扩大、心肌梗死特征性病理性心电图表现、血清TnⅠ升高等最为常见。
　　结论:
　　心脏超声各项指标中，冠状动脉充血态PDV和CFR可方便、有效、无创地预测心肌梗死小鼠的梗死面积。
　　二、腺苷和异氟烷对左心室压力超负荷和容量超负荷小鼠冠状动脉血流储备测量影响的差异性比较
　　背景和目的:
　　在小鼠冠状动脉血流储备（coronary flow reserve，CFR）的评定中，腺苷和高浓度异氟烷常用于诱导冠状动脉充血。然而，高浓度异氟烷可能引起心血管疾病小鼠的心功能恶化，导致CFR数值偏小。目前，尚未有研究比较腺苷和异氟烷对CFR和心功能测量的影响。
　　方法:
　　20只C57BL6/J小鼠行主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)，主动脉瓣返流(aortic regurgitation，AR)或相应的假手术。术后2周，行高分辨力超声和有创性血流动力学测量。分别通过计算充血态与静息态舒张期冠状动脉血流速度峰值的比值(the ratio of hyperemic to basal peak diastolic velocity，CFRpdv)，以及充血态与静息态舒张期冠状动脉血流速度时间积分的比值(theratio of hyperemic to basal diastolic velocity-time integral,CFRdvti)，计算出CFR。
　　结果:
　　假手术组腺苷和异氟烷对CFR、左心室收缩功能[左心室射血分数(leftventricular ejection fraction，LVEF)和左心室缩短分数(left ventricular fractionalshortening，LVFS)]、左心室收缩末期压力、心肌最大收缩和舒张速率(+dp/dt和-dp/dt)、左心室收缩末期和舒张末期压力差值(ALVP)和心肌最大收缩和舒张速度差值(Δdp/dt)的测量结果没有明显差异。然而，在TAC和AR小鼠中，使用腺苷获取的上述指标数值均明显大于使用异氟烷获取的相应数值。进一步发现，CFRpdv和CFRdvti均与LVEF和LVFS呈正相关。
　　结论:
　　TAC和AR小鼠使用高浓度异氟烷比腺苷获取的CFR低，这很可能与高浓度异氟烷对心功能的抑制作用有关。
　　三、超声生物显微镜早期估测压力超负荷小鼠左心室收缩末期压力和主动脉缩窄程度
　　背景和目的:
　　小鼠行主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)后，左心室收缩末期压力(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)升高程度和心肌肥大反应程度存在一定的变异，导致造模不稳定。以往通过使用压力导管测定左心室内压力变化来筛选造模成功的小鼠，但是这个方法有创且难以重复。我们试图使用超声生物显微镜(ultrasound biomicroscopy，UBM)，早期无创性筛选出TAC造模成功的小鼠。
　　方法:
　　实验一共使用了55只C57BL/6J小鼠，其中随机抽取45只行TAC，其余10只为对照组。在TAC前、TAC术后3天和TAC术后14天分别行UBM检测。在术后14天，行Millar压力导管检测LVESP。压力检测后取材进行病理切片，行常规HE染色。
　　结果:
　　以LVESP≥150 mmHg视为造模成功(TAC+)，＜150 mmHg视为造模失败(TAC-)，受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析显示，术后3天主动脉缩窄处内径(inner diameter at aortic banding site，IDb)、主动脉缩窄处血流速度峰值(peak flow velocity at aortic banding site，PVb)、右/左颈总动脉血流速度峰值比（peak flow velocity of right/left commoncarotid artery，PVr/I）能最好地预测术后14天的LVESP（曲线下面积分别为0.9016、0.9143和0.8254，P均＜0.01）。在术后3天的所有UBM指标中，IDb、PVb、右颈总动脉血流速度峰值(right common carotid artery peak flow velocity，PVr)、PVr/I与术后14天的LVESP相关性最好（R2分别为0.5740、0.6549、0.5208和0.2274，P均＜0.01）。我们进一步发现，当术后3天的IDb、PVb和PVr/I参考值分别为0.45 mm、2698.00 mm/s、3.08时，能最为有效地预测TAC术后14天的心肌肥厚程度。
　　结论:
　　UBM能无创而有效地早期筛选TAC造模成功的小鼠。
　　第二部分 奥美沙坦通过激活DLL4/Notch1缓解压力超负荷小鼠心脏重构
　　背景和目的:
　　Notch信号通路调控应激状态下心脏的适应性改变。我们因此欲验证一种广泛使用的血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂奥美沙坦(olmesartan)，能否通过DLL4/Notch1信号通路延缓压力超负荷小鼠心脏重构和心功能失代偿。
　　方法:
　　通过主动脉缩窄(transverse aortic constriction，TAC)制作小鼠心脏压力超负荷模型。35只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组、TAC组、TAC+olmesartan组和TAC+olmesartan+DAPT组（DAPT:γ一分泌酶抑制剂，Notch信号通路抑制剂）。术后第1天起通过灌胃法输进生理盐水(10 ml·kg-1·d-1)和等体积奥美沙坦溶液(3 mg·kg-1·d-1)，DAPT(10μmol·kg-1·d-1)通过腹腔注射给药。术后28天，行心脏超声、血流动力学测量和病理切片。定量PCR检测胚胎基因心房利钠肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和骨骼肌a-肌动蛋白（skeletal-αactin，SAA）的表达。蛋白印迹法检测Notch信号通路相关蛋白和胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2，ERK1/2)的水平。酶联免疫吸附试验法检测血清Angll浓度。
　　结果:
　　压力超负荷导致左心室心肌肥厚、心功能不全、心肌纤维化和心肌微循环功能障碍，以及Angll、ERK1/2和胚胎基因表达升高。奥美沙坦通过激活DLL4/Notch1信号通路，降低左心室肥厚、心肌纤维化，保护心功能，改善毛细血管密度和冠状动脉动脉灌注情况。这些疗效在使用DAPT抑制Notch1信号通路后消失。
　　结论:
　　我们发现奥美沙坦可通过激活DLL4/Notch1信号通路，改善压力超负荷小鼠心脏重构和心功能不全，这是奥美沙坦药理作用新机制，有望成为高血压治疗的新靶点。

目录

摘要

英文缩略语

引言

第一部分 新型小鼠心血管病理生理平台建立

一、超声冠状动脉血流灌注对心肌梗死小鼠梗死面积的无创性评估

前言

材料和方法

结果

讨论

局限性

结论

二、腺苷和异氟烷对左心室压力超负荷和容量超负荷小鼠冠状动脉血流储备测量影响的差异性比较

前言

材料和方法

结果

讨论

局限性

结论

三、超声生物显微镜早期估测压力超负荷小鼠左心室收缩末期压力和主动脉缩窄程度

前言

材料和方法

结果

讨论

局限性

结论

第二部分 奥美沙坦通过激活DLL4／Notch1缓解压力超负荷小鼠心脏重构

前言

材料和方法

结果

讨论

局限性

结论

课题综述一 超声多普勒冠状动脉血流成像在小鼠心血管疾病模型中的应用价值和现状

课题综述二 Notch信号通路对于心脏重构的影响

参考文献

附录：论文发表与学术交流

致谢

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