过氧化物酶6对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复的影响

摘要

研究过氧化物酶6（Peroxiredoxin-6，Prdx6）对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复作用的影响，并对Prdx6对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复作用机制进行初步探究。
　　昆明种小鼠90只，雌雄各半，建立小鼠深Ⅱ度烫伤模型，随机分为模型组（外涂PBS），实验组（外涂Prdx6），阳性对照组（外涂外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，rh-bFGF），每组30只，每日给药四次，连续给药21 d。肉眼观察记录各组实验小鼠皮肤创面愈合状况，包括：创面组织红肿程度，创面颜色变化，炎性渗出程度，毛发生成时间，结痂面积等，并对各组小鼠皮肤形态学变化进行拍照统计。观察记录小鼠皮肤创面愈合时间，采用干湿法计算创面组织含水量，运用描记称重法计算创面愈合率。分别于烫伤后5 d，10 d，14 d，取创面组织，Bouin氏液进行固定，按照常规方法石蜡包埋、石蜡切片、进行苏木精-伊红（H-E）染色，光镜下观察创面病理学改变；分别于烫伤后5 d，10d，取模型组（PBS），实验组（Prdx6）小鼠皮肤进行组织匀浆，对创面组织丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量进行测定；采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测烫伤皮肤组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1-β（IL-1β）、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10（IL-10）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、Fas、FasL、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）的mRNA表达水平；采用蛋白质免疫印迹法（western blot）检测烫伤皮肤组织中JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白含量表达变化。
　　1. Prdx6对创面愈合时间的影响：与模型组相比，Prdx6组小鼠创面愈合时间较短，且愈合过程中，炎性渗出较少，皮肤颜色较为红润，无皮肤坏死现象。Prdx6组小鼠皮肤结痂面积小，新生皮肤颜色与原始皮肤更为相近。
　　2. Prdx6对创面愈合率的影响：实验第5 d，10 d，14 d，Prdx6组小鼠皮肤创面愈合率均大于模型组，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3. Prdx6对组织含水量的影响：实验第5d，Prdx6组小鼠皮肤创面组织含水量小于模型组，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。
　　4. H-E观察发现，与模型组相比，Prdx6组小鼠皮肤皮肤组织水肿较轻，表皮增生较快，新生肉芽组织形成较快，且新生表皮较厚。
　　5.烫伤后，皮肤组织MDA含量迅速升高，SOD含量迅速降低，实验第5、14d，Prdx6组皮肤组织中MDA含量较低，SOD含量较高，且与模型组存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。
　　6.实验第5、14d，Prdx6组TNF-α、IL-1β、VEGF含量较模型组低，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）；实验第14d，IL-6的mRNA表达量与模型组相比较低，且存在显著性差异（P＜0.01）。实验第5d，IL-10 mRNA表达量与模型组相比较高，且存在显著性差异（P＜0.01）。
　　7.实验第5、14d，Prdx6组的caspase-3、caspase-9、Fas mRNA表达量与模型组相比较低，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。实验第5d，FasL的mRNA表达量与模型组相比较低，且存在显著性差异（P＜0.01）。
　　8.实验第5d，Prdx6组的p-p38、p38、p-p38/p38蛋白表达量与模型组比较均明显降低，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。实验第5、14d，p-JNK、JNK、p-JNK/JNK蛋白表达量与模型组比较均明显降低，且存在显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。
　　Prdx6在小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复过程中可缩短创面愈合时间，提高创面愈合率，降低炎症反应，缩小结痂面积，对烫伤皮肤创面愈合具有很好的修复作用。其作用机制可能与降低皮肤损伤过程中脂质过氧化反应，保护SOD等抗氧化酶活性，降低caspase-3、caspase-9、Fas及FasL等凋亡因子的表达量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6表达，提高IL-10表达量，降低皮肤组织中p-JNK/JNK、p-p38/p38值，减轻氧化应激，减轻细胞凋亡及局部炎症反应对皮肤的损伤等有关，Prdx6对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复作用与p38MAPK及JNK信号通路存在着一定的联系。

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符号说明

1 前 言

1.1 烫伤创面愈合研究进展

1.1.1 烫伤及其分类

1.1.2 烫伤创面愈合的基本过程

1.1.3 烫伤的主要治疗药物

1.2 Peroxiredoxins家族概述

1.2.1 Peroxiredoxins家族分类

1.2.2 Peroxiredoxins家族主要生物学功能

1.2.3 Prdx6结构简介

1.2.4 Prdx6主要功能及作用机制

1.3 MAPK信号通路简介

1.3.1 MAPK信号通路的组成

1.3.2 JNK信号通路简介

1.3.3 p38MAPK信号通路简介

2 Prdx6对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合作用

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物

2.1.2 实验药品

2.1.3 实验试剂

2.1.4 实验器材

2.1.5 试剂配制方法

2.2 实验方法

2.2.1 小鼠深Ⅱ度烫伤模型的建立

2.2.2 统计法记录皮肤创面愈合时间及形态学变化

2.2.3 描记称重法检测创面愈合率

2.2.4 干湿法测定创面组织含水量

2.2.5 H-E检测烫伤皮肤组织病理学变化

2.2.6 统计学处理方法

2.3 实验结果

2.3.1 Prdx6对创面愈合时间及形态学变化的影响

2.3.2 Prdx6对创面愈合率的影响

2.3.3 Prdx6对组织含水量的影响

2.3.4 Prdx6对创面组织病理结构变化的影响

2.4 讨论

3 Prdx6对小鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合修复作用机制

3.1 实验材料

3.1.1 实验样本

3.1.2 实验药品

3.1.3 实验试剂

3.1.4 实验器材

3.1.5 试剂配制方法

3.2 实验方法

3.2.1 BCA法测定蛋白浓度

3.2.2 MDA含量测定

3.2.3 SOD含量测定

3.2.4 RT-PCR检测Prdx6对相关基因表达水平的影响

3.2.5 Western-Blot法检测Prdx6对相关蛋白表达水平的影响

3.2.6 统计学处理方法

3.3 实验结果

3.3.1 Prdx6对皮肤MDA含量变化的影响

3.3.2 Prdx6对皮肤SOD含量变化的影响

3.3.3 Prdx6对皮肤相关基因表达水平变化的影响

3.3.4 Prdx6对相关蛋白表达水平的影响

3.4 讨论

4 结 论

参考文献

致谢

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