环境激素邻苯二甲酸二环己酯和邻苯二甲酸二丁酯荧光免疫分析新方法研究

摘要

环境激素类邻苯二甲酸酯是一类重要的环境激素物质。它干扰生物为保持体内平衡并调节生长过程的正常激素的产生、释放、转移、代谢、反应和消除，或在未受损的生物后代中引起不良的健康影响和内分泌功能的改变。近年来，随着工业生产和塑料制品的使用，塑料垃圾的大量增加，邻苯二甲酸酯不断进入环境，已成为全球性最普遍的污染物之一，广泛存在于大气、水体、土壤、生物体等自然环境中。 目前文献报道对邻苯二甲酸酯监测的方法主要是GC、HPLC和GC/MS。但是这些分析方法将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰的前处理过程十分复杂，操作费时，分析成本昂贵。因此，有必要开发一种简单、快捷且经济的检测技术。免疫分析技术以其快速、灵敏度高、经济、样品所需量少等优点而成为21世纪最具竞争性和挑战性的监测分析技术。目前，免疫分析技术应用于小分子物质的监测日益受到重视，已经成为监测分析环境中痕量污染物研究的热点。 经文献调研发现，用免疫分析方法测定环境激素物质的报道很少。这表明免疫分析技术用于分析环境激素物质有很大的发展前景，有待进一步研究。为此，本文研究的目标是建立测定环境激素类邻苯二甲酸酯的免疫分析新方法。围绕这一目标，主要进行了以下几个力面的研究工作： 一．用本课题组提供的邻苯二甲酸二环己酯全抗原和邻苯二甲酸二丁酯全抗原免疫兔子，从兔子血清中获得了邻苯二甲酸二环己酯和邻苯二甲酸二丁酯抗体。并对制备的这两种抗体进行了纯化。二．用制备的邻苯二甲酸二环己酯抗体包被酶标板，以酶联免疫双抗夹心法为基础，以异硫氰酸荧光素为荧光探针，研究了双抗夹心免疫反应的条件，建立了邻苯二甲酸二环己酯抗体包被荧光免疫分析新方法和竞争荧光免疫分析新方法。该方法灵敏度高，选择性好,线性范围宽，用该方法测定自来水和饮用水中的邻苯二甲酸二环己酯，结果令人满意。 三．用制备的邻苯二甲酸二丁酯抗原和抗体分别包被酶标板，以酶联免疫双抗夹心法为基础，以异硫氰酸荧光素为荧光探针，研究了双抗夹心免疫反应的条件，建立了邻苯二甲酸二丁酯抗原包被和抗体包被荧光免疫分析新方法。该方法灵敏度高，选择性好，线性范围宽，用该方法测定自来水和饮用水中的邻苯二甲酸二丁酯，结果令人满意。

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第一章绪论

1.1课题研究背景

1.1.1环境激素的概念

1.1.2环境激素影响人体健康的机制

1.1.3环境激素对人体健康的危害

1.1.4环境激素的分类

1.2邻苯二甲酸酯的理化性质

1.3邻苯二甲酸酯的环境激素行为

1.4邻苯二甲酸酯在环境中存在情况

1.4.1大气

1.4.2 水体

1.4.3人体、生物、底泥及其他

1.5免疫分析方法简介

1.5.1化学发光免疫分析

1.5.2荧光免疫分析

1.5.3电化学免疫分析

1.5.4放射免疫分析（RIA）

1.5.5酶免疫分析法

1.6课题研究的目的和意义

1.7课题研究的要点和创新点

第二章邻苯二甲酸酯抗体的制备

2.1引言

2.2实验材料和仪器

2.2.1实验材料

2.2.2实验仪器

2.3实验方法

2.3.1佐剂抗原的制备

2.3.2免疫途径

2.3.3效价的测定

2.3.4采血

2.3.5抗体的分离和纯化

2.3.6紫外线(UV)吸收法测定蛋白质浓度

2.3.7抗体特异性的考察

2.4结果与讨论

2.4.1抗原免疫剂量

2.4.2抗体效价的测定

2.4.3抗体的产生过程

2.4.4抗血清的分离和提纯

2.4.5抗体的特异性

第三章标记抗体及纯化

3.1引言

3.1.1免疫标记技术概述

3.1.2荧光素标记蛋白技术

3.1.3标记原理

3.2材料和试剂

3.3实验步骤

3.3.1直接标记法（称热标记）

3.3.2标记lgG的纯化

3.4结果和讨论

3.4.1荧光素的选择

3.4.2标记lgG的鉴定

第四章抗体包被荧光免疫法测定邻苯二甲酸二环己酯

4.1引言

4.2实验所需仪器和试剂

4.2.1主要仪器设备

4.2.2实验所需试剂：

4.3实验步骤

4.4流程说明

4.5抗体包被荧光免疫分析工作条件的优化

4.5.1包被液浓度的选择

4.5.2PH的影响

4.5.3温育温度和时间的影响

4.5.4PBST浓度的影响

4.5.5标准曲线的绘制

4.5.6交叉反应

4.6样品测定及回收实验

4.7小结

第五章竞争荧光免疫法测定邻苯二甲酸二环己酯

5.1引言

5.2实验试剂、器材

5.2.1主要仪器设备

5.2.2实验所需试剂

5.3实验步骤

5.4实验条件优化

5.4.1标准曲线的绘制

5.4.2交叉反应

5.5水样测定及回收实验

5.6小结

第六章抗体包被荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丁酯

6.1引言

6.2实验所需仪器和试剂

6.2.1主要仪器设备

6.2.2实验所需试剂：

6.3实验步骤

6.4抗体包被荧光免疫分析工作条件的优化

6.4.1包被液浓度的选择

6.4.2标准抑制曲线、工作曲线、检出限和精密度

6.4.3交叉反应

6.5水样测定及回收实验

6.6小结

第七章抗原包被荧光免疫法测定邻苯二甲酸二丁酯

7.1引言

7.2实验所需仪器和试剂

7.2.1主要仪器设备

7.2.2实验所需试剂：

7.3实验步骤

7.4抗原包被荧光免疫分析工作条件的选择

7.4.1包被液浓度的选择

7.4.2标准抑制曲线、工作曲线、检出限和精密度

7.4.3交叉反应

7.5水样测定及回收实验

7.6小结

第八章总结与展望

8.1抗体的制备

8.2抗体的标记及纯化

8.3荧光免疫分析

8.4荧光免疫分析法的前景

8.5需要进一步研究的问题

参考文献

附录

硕士期间发表文章

致谢