邻苯二甲酸二丁酯的酶联免疫吸附分析研究

摘要

邻苯二甲酸二丁酯(DBP)属于邻苯二甲酸酯类化合物的一员。主要用作硝基纤维素漆的增塑剂,也可作为聚氯乙烯和聚醋酸乙烯等塑料的增塑剂。同时是防沫剂、乳胶粘合剂以及纺织纤维润滑剂的工业原料,还可用作染料和杀虫剂的溶剂。这些材料广泛用于制造我们的日常生活用品,例如:塑料制品、油漆、胶水、驱虫剂、香水、发胶、指甲油等。
　　DBP可在其生产或掺入到塑料、粘合剂和染料的过程中释放到环境。另外由于DBP不与终产品共价结合,随着使用时间的推移,可不断地释出进入到环境。环境中的DBP可通过呼吸、饮食以及皮肤接触等多种途径进入人体。近年来,DBP被认为是一种环境内分泌干扰物,具有生殖毒性、发育毒性以及潜在的致癌性等。为了更好测定DBP在环境中的污染水平以及评价暴露于环境中的DBP产生的潜在不利影响,必须建立一种快速、简便、灵敏、费用低廉的方法检测DBP在环境和生活用品中的残留量。
　　目前国内外对DBP的监测方法主要有气相色谱-质谱联用(GC-MS)和高效液相色谱法(HPLC)等技术,但这些分析方法对仪器条件要求高,前处理的操作过程相对复杂、耗时。免疫分析特别是酶联免疫吸附分析(ELISA)由于不需要昂贵的仪器设备,且特异性强、灵敏度高、操作简便快捷,在现场筛选和大量样本的快速检测中显示了其独特的优势。
　　本研究以4-硝基邻苯二甲酸和正丁醇为原料,经过酯化、还原合成了具有DBP结构特征的半抗原4-氨基邻苯二甲酸二丁酯(DBAP)。用重氮化法将DBAP与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联得到人工抗原DBAP-OVA和DBAP-BSA。用DBAP-OVA免疫BALB/c小鼠获得了高效价、高灵敏度的抗血清。利用淋巴细胞杂交瘤技术制备并筛选出了1株能稳定分泌抗DBP抗体的杂交瘤细胞株DBP-4E9,其染色体数目为96~105条,分泌抗体的亚型为IgG1。小鼠腹水法大量制备的DBP单抗经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化,纯度为91.1％,回收率为68.3％。
　　基于此单抗的ELISA最适检测条件是:以1％OVA作封闭剂;竞争反应体系为含10％ DMF、1.6％ NaCl、0.1％ BSA的0.01 mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液;25℃竞争反应1.5h。建立的人工抗原包被间接竞争ELISA在包被抗原DBAP-BSA浓度为0.25μg/mL,单抗工作浓度为62.5 ng/mL时,对DBP的线性检测范围是11.56~863.72μg/L,最低检测限(LD)为(9.21±1.28)μg/L。此外还建立了一种新颖的半抗原包被间接竞争ELISA检测DBP的含量。首先用酸性高锰酸钾将聚苯乙烯酶标板表面氧化衍生出羧基,再将半抗原DBAP通过水溶性碳二亚胺(EDC)共价交联到羧化的聚苯乙烯酶标板上。在DBAP包被,单抗工作浓度为500 ng/mL时,此法灵敏度比人工抗原包被间接竞争ELISA提高了10倍,线性检测范围是2.16~155.92 gg/L,LD可达(0.93±0.20)μg/L。
　　所获得的DBP单抗除了与邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)和半抗原DBAP有一定的交叉反应(分别为21.5％和27.1％),而与其它常用的几种邻苯二甲酸酯类化合物均无交叉反应。用所建立的半抗原包被间接竞争ELISA对自来水和东湖水样进行的DBP添加回收试验结果显示,回收率分别为90.5~102.7％和92.4~100.5％。
　　检出某品牌食品保鲜袋、一次性塑料杯和指甲油中DBP含量分别为(1.60±0.22) mg/kg、(1.91±0.21) mg/kg和(0.43±0.03) mg/kg。检测灵敏度和准确性可以满足水环境中DBP的残留检测要求,并可用于塑料制品和化妆品中DBP含量的检测。

目录

摘要

Abstract

1. 绪论

1.1 邻苯二甲酸二丁酯的性质及应用

1.2 邻苯二甲酸二丁酯的残留和人群暴露

1.3 邻苯二甲酸二丁酯的危害

1.4 邻苯二甲酸酯类化合物的检测方法

1.4.1 色谱法

1.4.2 免疫分析法

1.5 有机小分子酶联免疫吸附分析技术

1.5.1 人工抗原的制备

1.5.2 抗体的制备

1.5.3 有机小分子酶联免疫吸附分析的类型

1.6 选题的目的及意义

2.材料与方法

2.1 材料、试剂及仪器

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液

2.1.4 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 半抗原的合成及结构鉴定

2.2.2 人工抗原的合成及结构鉴定

2.2.3 BALB/c小鼠免疫

2.2.4 抗血清效价的测定

2.2.5 抗血清灵敏度的测定

2.2.6 单克隆抗体的制备

2.2.7 杂交瘤细胞染色体分析

2.2.8. 单克隆抗体的亚型分析

2.2.9 单克隆抗体的纯化

2.2.10 人工抗原包被ELISA检测方法的建立与优化

2.2.11 半抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立

2.2.12 单抗特异性分析

2.2.13 水样中DBP的添加回收试验及检测

2.2.14 消费品中DBP含量的检测

3. 结果

3.1 半抗原结构的鉴定

3.2 人工抗原结构的鉴定

3.2.1 紫外光谱

3.2.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.3 抗血清效价

3.4 抗血清灵敏度

3.5 杂交瘤细胞株的建立

3.6 杂交瘤细胞染色体分析

3.7 单克隆抗体亚型分析

3.8 单克隆抗体的纯化

3.9 人工抗原包被ELISA检测条件的优化

3.9.1 最适包被抗原浓度和抗体工作浓度的确定

3.9.2 竞争反应温度的确定

3.9.3 有机溶剂的种类及含量的影响

3.9.4 竞争反应体系pH的影响

3.9.5 竞争反应体系离子强度的影响

3.9.6 竞争反应体系去污剂含量的影响

3.9.7 封闭剂的选择

3.9.8 人工抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立

3.10 半抗原包被的间接竞争ELISA检测方法的建立

3.10.1 最适包被半抗原浓度和单抗工作浓度的确定

3.10.2 半抗原包被的间接竞争ELISA标准曲线的建立

3.11 单抗特异性分析

3.12 水样中邻苯二甲酸二丁酯的添加回收率

3.13 消费品中邻苯二甲酸二丁酯含量的检测

4. 讨论

4.1 邻苯二甲酸二丁酯人工抗原的合成

4.2 免疫方案

4.3 单克隆抗体的制备

4.3.1 骨髓瘤细胞的制备

4.3.2 杂交瘤细胞的选择培养

4.3.3 单克隆抗体纯化方法

4.4 反应条件对间接竞争ELISA的影响

4.5 半抗原包被ELISA

4.6 单克隆抗体的特异性

4.7 邻苯二甲酸二丁酯的ELISA检测

5. 结论与展望

6. 参考文献

附录1 主要英文缩写词

附录2 攻读学位期间发表的学术论文

致谢