基于明胶和壳聚糖复合静电纺纳米纤维制备小血管组织工程支架及其机械性能研究

摘要

组织工程学是一门将细胞生物学和材料学相结合的新兴学科。组织工程学通过将种子细胞种植于支架材料上，并在体外培养增殖，在形成新的组织后植入受损部位，从而达到修复和重建原人体组织结构和功能的目的。因此在组织工程中关键一步是提供这样一种支架材料。理想的组织工程支架应仿生天然细胞外基质的结构和生物学功能，并有良好的生物相容性和适当的力学性能。
　　本课题从仿生的角度出发，基于明胶和壳聚糖静电纺纳米纤维，从组成和结构上仿生天然细胞外基质。首先选择合适的溶液体系，将明胶和壳聚糖静电纺成纳米纤维，并系统地研究该复合纳米纤维的各项性能，包括表面形态、结晶结构、化学结构、力学性能和热学性能。结果表明，明胶和壳聚糖复合纳米纤维的平均直径低于两种组分单纺纤维的平均直径，并随着溶液浓度的增加，复合纳米纤维的平均直径亦增加;红外光谱分析发现明胶和壳聚糖分子之间相互形成氢键。X射线衍射分析显示，明胶和壳聚糖溶解后，物相结构发生变化，更趋向于无定型态，静电纺过程对材料的结晶性没有影响。TG和DSC分析显示了明胶和壳聚糖的热稳定性情况。随着壳聚糖含量的增加，复合纳米纤维的断裂应力和断裂应变均降低。
　　因为明胶和壳聚糖静电纺纳米纤维膜遇水即溶，为了提高复合纳米纤维膜的稳定性，因此用戊二醛作为交联剂，在密闭干燥器中通过戊二醛蒸气挥发对复合纳米纤维膜进行交联。探索最佳的交联时间，并研究戊二醛与明胶和壳聚糖以及其复合物的交联机理。结果表明，最佳的交联时间为3天;交联后，明胶和壳聚糖复合纳米纤维膜在37℃去离子水中浸泡4天后仍能保持其纤维结构;通过红外分析研究戊二醛的交联机理，壳聚糖与戊二醛的交联反应，主要是自由氨基与戊二醛的醛基之间反应生成Schiff碱(C=N)，乙酰基上N原子带有孤对电子，与戊二醛发生亲核反应，另外壳聚糖的羟基与戊二醛的羰基之间发生缩醛化反应。明胶中含有少量的具有氨基的赖氨酸和精氨酸，主要是它们的自由氨基与戊二醛的醛基发生交联反应。明胶和壳聚糖的复合物与戊二醛的交联反应，主要是自由氨基与戊二醛的醛基之间反应，生成亚胺，即Schiff碱，同时壳聚糖的羟基与戊二醛的羰基之间发生缩醛化反应。交联后，复合纳米纤维膜的平均断裂伸长率稍有下降，而平均断裂强度呈现不同程度的增加。细胞在不同比例的明胶和壳聚糖复合材料上都能很好地黏附;内皮细胞的增殖实验发现，内皮细胞在纳米纤维膜上保持一个较高的增殖能力，当明胶和壳聚糖复合比例为50/50时，细胞增殖最多。细胞可以在材料上很好黏附和增殖，也说明戊二醛蒸气交联的毒性很低。
　　虽然交联后，明胶和壳聚糖复合纳米纤维膜的力学性能有很大改善，但是断裂伸长率很低，力学性能较脆，不适合单独用作血管组织支架。因此混入合成材料聚己内酯，可以结合天然材料和合成材料的优势，开发出适合的组织工程支架。系统地研究该共混体系的静电纺纳米纤维表面形态、结晶性能、热性能、力学和亲疏水性能。扫描电镜结果显示，明胶和壳聚糖复合物的引入降低了聚己内酯的直径。通过差示扫描量热分析测试和X射线衍射分析测试发现聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物是简单的物理共混，这样能结合天然材料和合成材料的优点，有望得到生物相容性好，又具有很强机械性能的纳米纤维材料以构建血管组织工程支架材料。接触角实验发现纯聚己内酯纤维膜具有一个疏水性的表面，随着明胶和壳聚糖复合物组分的增加，纳米纤维膜的亲水性逐渐增加，但是当聚己内酯的含量在50％和25％时，静电纺纳米纤维表面出现溶解现象。再结合共混纤维膜的力学性能，当聚己内酯的含量为75％时，静电纺纳米纤维膜既有一定的强度，又具有良好的延伸性，因此选择该比例作进一步研究，并表示为PCL/CS-Gel。孔径大小及分布测试实验发现，孔径的大小与纤维的直径直接相关，纤维越细，孔径越小。对猪的髋动脉内皮细胞在共混纳米纤维膜上的黏附、增殖和细胞形态进行了研究，并和盖玻片和细胞培养板的细胞相容性做了对比。MTT实验结果表明，内皮细胞在静电纺纳米纤维上的黏附量高于对照组盖玻片上的细胞量，而且PCL/CS-Gel静电纺纳米纤维膜上的细胞黏附量也高于PCL纤维膜上的细胞量。增殖实验中，细胞培养板(TCP)上的细胞增殖量最高，PCL/CS-Gel纳米纤维膜比PCL上的细胞增殖量高。从扫描电镜照片上，可以观察到24h后，PCL/CS-Gel纳米纤维膜上的细胞量明显多于PCL和盖玻片上的细胞量，细胞在纳米纤维膜的表面呈多角的迁移态分布，保持着分化、增殖的形态。鉴于PCL/CS-Gel具有良好的力学性能，同时具有良好的细胞相容性，因此选用于静电纺制管状支架。
　　最后对PCL、PCL/CS-Gel静电纺管状支架以及静电纺与外层编织PLLA长丝复合管状支架的尺寸稳定性、径向力学性能、疲劳性和顺应性做了系统地研究。实验发现，PCL/CS-Gel静电纺管状支架的径向断裂强度和断裂伸长率比PCL低，外层编织PLLA长丝后，力学性能有显著提高。三种管状支架在浸泡三个月后，直径和厚度变化很小，说明三种管状支架都具有良好的尺寸稳定性。疲劳一定时间后，不同管状支架的径向力学性能断裂伸长率均有所降低。明胶和壳聚糖复合物的引入提高了聚己内酯静电纺管状支架的顺应性，在外层编织PLLA长丝后顺应性略有所降低。在浸泡三个月后，PCL静电纺管状支架的断裂强度能保持原来的77％，断裂伸长率没有显著性差异;PCL/CS-Gel静电纺管状支架的断裂强度和断裂伸长率均显著降低，而在外层编织PLLA长丝后，复合管状支架在三个月后的径向力学性能达到人体动脉径向力学性能的要求（动脉、肺动脉瓣和肌肉动脉），说明外层的编织结构对增强静电纺管状支架的力学性能有着积极的意义。
　　本文基于明胶和壳聚糖以及合成材料聚己内酯共混静电纺成纳米纤维，从组成和结构上仿生天然细胞外基质，同时具有良好的生物相容性，因此用作复合管状支架的内层材料。外层编织PLLA长丝对提高复合管状支架的力学性能有着积极的意义。通过对复合管状支架系统的测试，这对今后开展动物实验提供了重要的依据。

目录

声明

摘要

主要缩略词

第一章 绪论

1．1 组织工程学

1．1．1 组织工程的定义

1．1．2 组织工程支架

1．1．3 组织工程用生物降解材料

1．2 静电纺概述

1．2．1 静电纺原理及影响因素

1．2．2 静电纺纳米纤维在组织工程支架制备中的应用

1．2．3 静电纺纳米纤维对细胞生长行为研究

1．3 组织工程血管的研究进展

1．3．1 组织工程血管

1．3．2 组织工程血管材料

1．4 本文的研究内容及意义

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新点

参考文献

第二章 明胶和壳聚糖共混静电纺

2．1 引言

2．1．1 明胶和壳聚糖简介

2．1．2 明胶和壳聚糖在组织工程上的应用

2．2 实验部分

2．2．1 实验材料及溶剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 静电纺纺丝溶液的配制

2．2．4 纳米纤维的制备

2．2．5 纳米纤维的形态表征

2．2．6 红外光谱分析(FTIR)

2．2．7 X射线衍射分析(XRD)

2．2．8 热分析

2．2．9 力学性能研究

2．3 结果和讨论

2．3．1 纺丝溶液浓度对纳米纤维形态的影响

2．3．2 明胶和壳聚糖不同比例对纳米纤维形态的影响

2．3．3 静电纺纳米纤维膜的红外分析及相互作用研究

2．3．4 纳米纤维膜的X射线衍射分析

2．3．5 热分析

2．3．6 力学性能

2．4 小结

参考文献

第三章 明胶和壳聚糖复合静电纺纳米纤维膜的交联及性能研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验材料及试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 戊二醛蒸气交联条件的摸索

3．2．4 红外光谱分析

3．2．5 热分析

3．2．6 力学性能分析

3．2．7 膜状支架的生物学检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 交联时间的确定

3．3．2 红外光谱分析

3．3．3 交联后纤维膜的力学性能

3．3．4 内皮细胞的黏附与增殖

3．3．5 内皮细胞微观形貌观察

3．4 小结

参考文献

第四章 聚己内酯与明胶-壳聚糖复合物共混静电纺纳米纤维的制备和表征

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验材料及试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 静电纺

4．2．4 差示扫描量热测试(DSC)

4．2．5 接触角分析测试

4．2．6 力学性能测试

4．2．7 原子力显微镜观察

4．2．8 孔径测试

4．2．9 细胞培养

4．3 结果和讨论

4．3．1 聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物共混静电纺纳米纤维的形态分析

4．3．2 聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物共混静电纺纳米纤维差示扫描量热分析

4．3．3 聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物共混静电纺纳米纤维膜XRD分析

4．3．4 聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物共混静电纺纳米纤维膜的力学性能

4．3．5 聚己内酯与明胶和壳聚糖复合物共混静电纺纤维膜的亲疏水性

4．3．6 聚己内酯、PCL／CS-Gel以及明胶和壳聚糖复合物静电纺纳米纤维的表面形貌

4．3．7 聚己内酯及其PCL／CS-Gel静电纺纳米纤维膜的孔径及其分布

4．3．8 内皮细胞的黏附和增殖

4．4 小结

参考文献

第五章 组织工程血管支架的制备及机械性能表征

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 管状支架的制备

5．2．2 管状支架的尺寸稳定性

5．2．3 管状支架径向力学性能测试

5．2．4 管状支架的抗疲劳性测试

5．2．5 管状支架的顺应性测试

5．3 结果与讨论

5．3．1 管状支架的制备及径向力学性能研究

5．3．2 管状支架的尺寸稳定性

5．3．3 管状支架的抗疲劳性

5．3．4 管状支架的径向顺应性

5．3．5 管状支架干湿状态下径向力学性能比较

5．3．6 管状支架径向力学性能在PBS中浸泡不同时间后的变化

5．4 小结

参考文献

第六章 结论与展望

6．1 总结

6．2 后续工序建议

攻读博士学位期间发表的论文及专利申请

致谢