高产EPS的Pantoea ananatis野生株变异体的分离、鉴定及其作用机理研究

摘要

Pantoea ananatis(P.ananatis)是一种对许多重要经济农作物造成广泛危害的革兰氏阴性菌，尤其在麦穗成熟期侵染水稻而造成白叶枯病和不实，侵染洋葱的叶和茎，造成洋葱“中心腐烂”疾病和洋葱叶弯落。然而，P.ananatis的主要致病因子尚未完全明确。
　　 已有研究证实该植物病原菌毒性与其生产胞外多糖(EPS)相关。胞外多糖在植物病原菌入侵植物体，生物膜形成和枯萎病诱导方面起着至关重要的作用，被认为是许多植物病原菌的致病性决定性因素。研究表明，Pantoea stewartii一种引起玉米病变的病原体，其致病性随着胞外多糖合成基因群的突变而丧失。Erwinia amylovora，其变异体由于缺乏合成胞外多糖基因，致病性也随之减小。因此可以推断胞外多糖的合成与P.ananatis的病原性相关。本课题的研究目的就是确认并分离能大量生产胞外多糖的P.ananatis野生株的变异体，提取变异体的质粒DNA，鉴定突变基因，从而分析其与过量生产胞外多糖的关系。
　　 为了鉴定能大量生产胞外多糖的变异体的基因，用电击转化法将转座子Tn5-OT182导入P.ananatis野生株。利用含四环素的LB培养基培养得到野生株变异体的克隆体，克隆体于含四环素的TSB培养基上培养，一共得到大约3000个生产胞外多糖变异体的克隆体，并成功分离出其中21个能大量生产胞外多糖的变异体。为了确认变异基因，抽出变异体的染色体DNA，用四种限制性内切酶EcoRI，SacI，XhoI或HindⅢ进行酶切，染色体片段自我连结后导入大肠杆菌，用LB培养基培养后得到形质转换体。采用改良的碱裂解法提取质粒，通过BigDye Terminatorver.3.1和ABI Prism3100基因分析仪进行DNA测序。特异性的引物与其互补的序列杂交，将获得的DNA序列与DDBJ/EMBL/GenBank数据库比较，推断突变基因的表达功能。
　　 突变体33，91，40，11，46，81，29和98的突变基因分别与已知基因高度相似。能大量生产胞外多糖的变异体33，91和40的变异基因假定功能表达分别为黏性蛋白质，细胞外膜蛋白和脂蛋白，通过分析这些蛋白质功能，细胞表面结构的突变可能导致大量的胞外多糖的产生。变异体11的变异基因在从活性糖配体到单糖或非单糖受体的糖移动过程中起催化作用。变异体46和81变异基因的功能表达分别是糖基转移酶和铁离子运输脂蛋白，可能影响胞外多糖的合成。变异体29和98功能表达为感应蛋白质或核糖核苷酸酶R，可能与胞外多糖的成分之一核酸的合成有关。

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摘要

1 绪论

1．1 植物病原菌的研究现状

1．1．1 植物病原菌的研究发展

1．1．2 植物病原菌的危害

1．1．3 植物病原菌的寄生性与致病性

1．1．4 植物病原菌菌种鉴定方法

1．2 泛菌属的研究进展

1．2．1 泛茵属的来源

1．2．2 泛菌属的主要菌种

1．3 P.ananatis的研究进展

1．3．1 P.ananatis的致病性现象

1．3．2 P.ananatis的鉴定

1．3．3 P.ananatis的病原性机理

1．3．4 P.ananatis的制御

1．4 胞外多糖研究进展

1．4．1 胞外多糖的组成和结构

1．4．2 胞外多糖的作用与危害

1．4．3 胞外多糖的合成机理

1．4．4 胞外多糖的提取方法

1．4．5 胞外多糖的测定方法

1．5 变异体的制备

1．6 基因序列分析

1．6．1 质粒的提取与纯化

1．6．2 限制性内切酶的选择

1．6．3 质粒DNA提取与纯化效果检验

1．6．4 DNA扩增

1．7 课题研究意义和内容

1．7．1 课题研究意义

1．7．2 课题研究内容

1．7．3 课题研究技术路线

1．7．4 课题创新点及研究难点

1．7．5 课题预期目标

2 实验材料与设计

2．1 实验设计

2．2 实验材料与仪器

2．2．1 实验材料

2．2．1 实验药品

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 使用溶液的配制

2．3．2 培养基和培养液的制备

2．3．3 P.ananatis野生株的培养

2．3．4 电击转化法制备P.ananatis野生株变异体

2．3．5 胞外多糖的提取

2．3．6 大量生产胞外多糖的可能性变异体的鉴定与分离

2．3．7 染色体DNA的抽出

2．3．8 限制性内切酶的选择

2．3．9 形质转换体的制备

2．3．10 质粒DNA的提取与纯化

2．3．11 突变基因的鉴定

2．4 测定方法

2．4．1 胞外多糖的测定方法

2．4．2 质粒DNA纯度的测定及浓度的计算

3 高产EPS变异体的分离与鉴定

3．1 电击转化制备变异体

3．2 高产EPS变异体的分离

3．2．1 高产EPS变异体的筛选

3．2．2 变异体生产EPS量的测定

3．3 质粒DNA的提取与纯化

3．3．1 常规碱裂解法的优化

3．3．2 变异体质粒DNA的纯度及产率

3．4 高产EPS各变异体同源性分析

3．4．1 高产EPS各变异体突变基因的鉴定

3．4．2 高产EPS各变异体的同源性进化树

4 高产EPS变异体突变基因作用机理的分析

4．1 高产EPS变异体突变基因的功能表达

4．2 高产EPS变异体突变基因作用机理分析

4．2．1 变异体33的变异基因作用机理分析

4．2．2 变异体91的变异基因作用机理分析

4．2．3 变异体40的变异基因作用机理分析

4．2．4 变异体11的变异基因作用机理分析

4．2．5 变异体46的变异基因作用机理分析

4．2．6 变异体81的变异基因作用机理分析

4．2．7 变异体29的变异基因作用机理分析

4．2．8 变异体98的变异基因作用机理分析

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢