一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法

摘要

本发明涉及一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，包括：(1)野生草菇Vn菌株孢子的收集；(2)单孢分离株的获取；(3)单孢分离株同核体与异核体的鉴定。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、检测时间短、准确性高等优点，可以用于草菇杂交工作中亲本菌株的同核体与异核体判断，从而大幅度提高草菇育种效率，加快草菇新品种的研发，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于草菇菌株标记及检测领域，特别涉及一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株 同核体与异核体的方法。

背景技术

草菇(Volvariellavolvacea(BullexFr.)Sing)又名稻草菇、中国菇，属担子菌纲，伞菌目， 光柄菇科，小包脚菇属。草菇味道鲜美，营养丰富，鲜品中含蛋白质2.66％，脂肪2.24％，还 原糖1.66％，转化糖0.95％，灰分0.91％。在草菇蛋白质中含有18种氨基酸，包含人体不能够 合成的8种必需氨基酸。除食用价值外，草菇还具有提高人体免疫力、抑制癌细胞生长、解毒 等功效。在草菇栽培出菇中，完全使用天然原料(如稻草、玉米芯、棉籽壳等)，符合现代 人对绿色食品的要求。因此草菇一直深受人们的喜爱，是我国传统的出口创汇产品，远销至 美国、加拿大、英国、日本、新加坡、马来西亚等国家和地区。

由于草菇被认为是一种初级同宗结合的真菌，其菌丝细胞多核且无锁状联合，使得育种 者无法从形态上区分同核体与异核体，导致草菇遗传育种研究进展十分缓慢，只能借助传统 的驯化、组织分离、孢子分离等自然选择方法育种，造成草菇生产用种单一，严重阻碍了产 业的快速发展。面对这种情况，迫切需要开发一种快速鉴定草菇单孢分离株同核体与异核体 的检测方法，从而大大缩短草菇杂交育种进程，加快草菇新品种的研发。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核 体的方法，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、检 测时间短、准确性高等优点；该方法可用于草菇杂交工作中亲本菌株同核体与异核体的判断， 从而大幅度提高草菇育种效率，促进草菇新品种的研发。

本发明的一种快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法，包括：

(1)采用常规方法进行栽培出菇，待草菇Vn菌株的子实体进入成熟期后，将子实体置于孢 子收集器中，孢子收集器置于30-32℃培养箱中收集Vn菌株的孢子；

(2)挑取收集到的孢子，用无菌水稀释，血球计数板计数，然后进行梯度稀释，在加有氨苄 青霉素的PDA平板上涂布，置于30-32℃培养箱中培养；待孢子刚萌发时，挑取单个菌落于 新的PDA平板上培养，获得Vn单孢分离株；

(3)提取Vn单孢分离株的基因组DNA，然后以特异性检测标记引物为扩增引物，进行PCR 扩增，所得PCR产物经电泳检测后，即可区分Vn单孢分离株为同核体或异核体；其中，特 异性检测标记引物为A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；

A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；

A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；

A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。

所述步骤(1)中的孢子收集器内放有灭菌好的滤纸。

所述步骤(3)中的PCR扩增反应体系为：总体积25μL，12.5μL扩增混合液，待扩增基 因特异性引物对各0.5μL，50ng/μLDNA模板0.5μL，ddH₂O11μL(选用北京天恩泽基因科技 有限公司的即用型PCR试剂盒)。

所述步骤(3)中的PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火 30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。

所述步骤(3)中的电泳检测具体为：将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液 充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h， 待电泳结束后使用EB染色，并在紫外凝胶成像系统上进行拍照。

所述步骤(3)中的区分同核体或异核体的标准为：同核体扩增出其中一条条带，异核体 扩增出两条条带。

本发明通过克隆野生草菇Vn菌株的交配型基因序列，并分析序列的保守性，建立以交 配型基因为分子标记的快速鉴定野生草菇Vn单孢分离株同核体与异核体的方法。A3F/A3R、 A4F/A4R引物扩增出的DNA序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。

有益效果

(1)本发明的鉴定方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验等方法相比，具有操作简便、 检测时间短、准确性高等优点；

(2)利用本发明可以鉴定野生草菇Vn单孢分离菌株的同核体与异核体，应用于草菇单孢杂 交工作中亲本的筛选，从而大大缩短育种周期，加快草菇新品种的研发。

附图说明

图1为野生草菇Vn单孢分离菌株为同核体，其中1、2、3单孢分离株为A3类型的同核体， 4、5、6单孢分离株为A4类型的同核体；

图2为野生草菇Vn单孢分离菌株为异核体，其中1、2单孢分离株为A3/A4类型的异核体。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

野生草菇Vn菌株孢子的收集

制备野生草菇Vn菌株的栽培种，采用常规方法进行栽培出菇，待Vn菌株的子实体进入 成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器内放有灭菌好的滤纸，置于32℃恒温培 养箱中收集Vn菌株的孢子。

草菇Vn菌株常规栽培出菇的操作步骤如下：

(1)将棉籽壳和生石灰按照95：5(W)的比例混匀，润湿后堆制发酵3d作为培养料；

(2)将发酵好的培养料移至实验菇房的床架上，巴氏灭菌9h，冷却至31℃接种Vn菌 株；

(3)在草菇Vn菌株子实体生长期间，实验菇房的温度保持在30-32℃。

野生草菇Vn单孢分离株的获取

用灭菌的枪头挑取少量收集到的孢子，用无菌水稀释，血球计数板计数，并进行梯度稀 释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于32℃恒温培养箱中培养。待孢子刚萌发时， 挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn的单孢分离株。

单孢分离株同核体的鉴定

提取Vn单孢分离株的基因组DNA，并以下述的特异性检测标记引物为扩增引物，引物 的序列如下：

A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；

A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；

A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；

A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。

进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系(25μL)：北京天恩泽基因科技有限公司的即用 型PCR试剂盒扩增混合液12.5μL，待扩增特异性检测标记引物对各0.5μL，DNA模板 (50ng/μL)0.5μL，ddH₂O11μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退 火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。

将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的琼 脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并在 紫外凝胶成像系统上拍照。若凝胶图像上显示只扩增出其中一条条带，即可鉴定Vn的单孢 分离株为同核体，如图1所示。

实施例2

野生草菇Vn菌株孢子的收集

制备野生草菇Vn菌株的栽培种，采用常规方法进行栽培出菇，待Vn菌株的子实体进入 成熟期后，将子实体置于孢子收集器中，孢子收集器内放有灭菌好的滤纸，置于32℃恒温培 养箱中收集Vn菌株的孢子。

草菇Vn菌株常规栽培出菇的操作步骤如下：

(1)将棉籽壳和生石灰按照95：5(W)的比例混匀，润湿后堆制发酵2d作为培养料；

(2)将发酵好的培养料移至实验菇房的床架上，巴氏灭菌10h，冷却至32℃接种Vn菌 株；

(3)在草菇Vn菌株子实体生长期间，实验菇房的温度保持在30-32℃。

野生草菇Vn单孢分离株的获取

用灭菌的枪头挑取收集到的孢子少量，用无菌水稀释，血球计数板计数，并进行梯度稀 释，在加有氨苄青霉素的PDA平板上涂布，置于32℃恒温培养箱中培养。待孢子刚萌发时， 挑取单个菌落于新的PDA平板上培养，获得Vn的单孢分离株。

单孢分离株异核体的鉴定

提取Vn单孢分离株的基因组DNA，并以下述的特异性检测标记引物为扩增引物，引物 的序列如下：

A3F：GGAATGGTGCCCGACACGATACAG；

A3R：GGGTGTTGTTGAGGTTCGGTTGC；

A4F：TTGGTGCGGTCATCAACATTAG；

A4R：GTGAGCGGGTGATGTTGACGAT。

进行PCR扩增，其中PCR扩增反应体系(25μL)：北京天恩泽基因科技有限公司的即用 型PCR试剂盒扩增混合液12.5μL，待扩增特异性检测标记引物对各0.5μL，DNA模板 (50ng/μL)0.5μL，ddH₂O11μL。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退 火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃补平10min。

将PCR扩增产物与等体积的6×溴酚蓝上样缓冲液充分混匀，取5μL混合液在1.5％的 琼脂糖凝胶上进行电泳；电压设为100V，电泳时间为0.5h，待电泳结束后使用EB染色，并 在紫外凝胶成像系统上拍照。若凝胶图像上显示扩增出两条条带，即可鉴定Vn的单孢分离 株为异核体，如图2所示。