三株优良藻株的分离鉴定、培养条件改造及PEPC酶的初步研究

摘要

微藻是能够利用光能进行光合作用的微生物,它能吸收CO2合成自身生长所需要的物质,普遍具有生长周期短、易培养、生物量高等特点,而且许多微藻含油量高、还富含虾青素等次级代谢产物。所以在能源领域,微藻生物柴油被视为可替代化石燃料的新能源;在医疗保健领域,从藻细胞内提取多不饱和脂肪酸及高附加值色素等已成为开发热点。因而,微藻产业被世界广泛关注、研究。
　　本文通过对内蒙古乌梁素海淡水水体及天津塘沽东疆港海水水体进行大量筛选,获得三株优势藻株,并对其进行评价、培养条件改造以及分子生物学鉴定,并对微拟球藻油脂代谢过程中关键酶PEPC进行初步研究,主要研究结果如下:
　　1、成功筛选得到三株优势藻株XJ307、XJ308、XJ309,其生物量分别为细胞干重1.2g/L、0.86g/L、0.48g/L,含油量分别为50.3％、34.6%和40.5%。XJ307藻株为淡水藻株,含高附加值多不饱和脂肪酸AA和EPA,含量分别占总油脂的0.52%和5.12%,XJ308为产虾青素海水藻株,虾青素含量为0.43%细胞干重,XJ309为海水藻株,脂肪酸成分主要以C16和C18系为主,极少含长链脂肪酸组分。三株藻种性状均适合作为制备生物柴油原料。
　　2、通过光学显微镜及电镜观察形态,XJ307为单细胞微藻,中部膨大,末端较尖,两个色素体对称分布;XJ308、XJ309以单细胞形式存在,为球形藻,细胞为绿色,无鞭毛;其中XJ308在前期培养藻细胞为绿色,在后期受胁迫后藻细胞逐渐变红,叶绿体片层明显。利用18SrDNA在进化上的保守性,对XJ307、XJ308和XJ309进行18SrDNA序列扩增,通过测序后构建进化树分析,命名XJ307为菱形藻属,Nitzschiasp.XJ307;XJ308为栅藻属,Scenedesmussp.XJ308;XJ309为绿藻属,Chlorococcumsp.XJ309。
　　3、柱式培养条件下,以f/2培养基为基础,对XJ308、XJ309进行氮源浓度改造。NaNO3浓度为0.6g/L时,藻株XJ308可实现资源开发最大化,油脂产率为100.27mg/L/day,虾青素产量为19.61mg/L。NaNO3浓度为0.1g/L时,XJ309油脂产率最大达22.74mg/L/day。开放式培养150L跑道池培养条件下,f/2作培养基,XJ309生物量低。改造NaNO3初始浓度为750mg/L的海水BG11作为培养基,XJ309生物量最高达到2g/L,油脂含量经积累可达25.43%,产率可达到干重达到21.68g/m2/day。并构建了基于开放式跑道池光照强度、温度及NaNO3消耗与微藻生长之间的数学模型,在一定程度上揭示了微藻生长与光照强度、温度及NaNO3消耗之间的内在关系。
　　4、利用尼罗红快速检测油脂含量,在不同NaNO3浓度条件下测得油脂含量明显差异时,提取测定PEPC酶活。微拟球藻在NaNO3浓度30mg/L时,油脂含量为1306.9mg/L,PEPC酶活为13.73U/mL;75mg/L条件下油脂含量为1182.0mg/L,PEPC酶活为14.91U/ml,高浓度150mg/L时,油脂含量为540mg/L,PEPC酶活为29.77U/ml。PEPC酶活高,减少了C源流向油脂合成,而导致油脂含量下降。
　　通过对筛选获得的三株优势藻株的研究评价,可为微藻规模化生产生物柴油、提取多不饱和脂肪酸(PUFAs)和高附加值色素等薇藻综合化产业应用奠定基础。

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引言

1 文献综述

1.1 微藻概述

1.2 微藻油脂形成机制

1.3 本课题研究目的及主要内容

2 优良藻种的藻种筛选、纯化

2.1实验材料与仪器

2.2实验方法

2.3实验结果与讨论

2.4本章小结

3 藻种鉴定

3.1实验材料与仪器

3.2试验方法

3.3 实验结果与讨论

3.4本章小结

4 优良藻株培养条件改造

4.1实验材料与仪器

4.2试验方法

4.3实验结果

4.4本章小结

5 油脂合成中PEPC酶活测定

5.1实验仪器与材料

5.2实验方法

5.3实验结果

5.4本章小结

结论

参考文献

附录A BG11及f/2培养基配方

附录B XJ307、XJ308、XJ309 18S rDNA序列

在学研究成果

致谢