辛基吡喃葡萄糖苷作为新型环保的去细胞试剂制备组织工程支架的研究

摘要

目前商业上使用的心脏瓣膜替代物都不具有任何可再生的或者生长的潜能。因此构建有活性的、能够生长、修复和重塑且没有免疫性反应和具有抗凝作用的心脏瓣膜一直是组织工程心脏瓣膜研究的主要课题。有许多不同的方法制备在结构和功能上尽可能类似天然瓣膜的支架，同时满足自体细胞的增殖。经过去细胞的哺乳动物组织是由细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成的生物支架，已经被广泛应用在外科手术重建和组织和器官的再生医学领域。
　　 最理想的去细胞方法是保存ECM完整的组成成分和三维超微结构，但所有的去细胞方法都会导致结构的破坏和表面结构组成的潜在的丢失。有很多因素影响脱细胞的效果，包括组织和器官的细胞结构、密度，脂类含量和厚度等。去细胞的目的是使这些负效降到最低而不是完全避免。
　　 本文使用一种新型环保无毒可降解的去污剂—辛基吡喃葡萄糖苷(Octyl-glucopyranoside，OGP)进行去细胞处理得到ECM支架材料，并与另外两种常用的去污剂处理方法—十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate，SDS)和脱氧胆酸钠联合曲拉通(sodium deoxycholate and tert-octylphenylpolyoxyethylen(Triton X-100), SDT)进行比较，旨在为组织工程心脏瓣膜的构建提供一种组织结构和成分保存完整的具有良好生物相容性的支架。主要研究内容如下:
　　 (1)首次采用OGP对猪心包进行去细胞处理，并对不同浓度的OGP(0.5％(w/v)、1％（w/v）、2％(w/v)和5％(w/v))进行去细胞效果的研究。通过苏木精-伊红(haematoxylin and eosin，HE)染色和魏格特染色法(Weigert stain)从组织学上评价其脱细胞效果。HE和Weigert染色观察显示，新鲜猪心包内有大量细胞且分布均匀，纤维连续性好，呈波浪状，排列较整齐，较致密，弹力纤维清晰、连续，弹力纤维散在分布于纤维层间，基本与纤维层整体走向相对一致;0.5％OGP能够去除大部分细胞，且能较好地保存基质结构，但有细胞残骸存在;1％OGP、2％ OGP和5％ OGP能够完全去除猪心包中的细胞，1％ OGP能够较好地保存组织结构，处理后的猪心包组织学形态与天然猪心包类似;但当OGP浓度分别为2％和5％时，处理后的猪心包的胶原纤维和弹性纤维结构被破坏，这说明OGP浓度较高时会损害基质结构。本实验结果证明，当OGP浓度为1％(w/v)时，OGP脱细胞效果较好，不仅能去除猪心包内大部分细胞且保存了以胶原纤维和弹性纤维为主要成分的心包材料的结构和成分的完整性，对基质的损伤较小。
　　 (2)研究了1％(w/v) OGP与SDS和SDT脱细胞处理的效果。组织学染色（HE染色、Weigert染色和Mavot五色染色）结果表明OGP能够完全去除细胞且保存ECM的结构，SDS也能完全脱除细胞但对基质结构破坏较大，SDT只能去除部分细胞且对基质也有一定损伤。DNA含量测定结果进一步表明，OGP和SDS能够去除绝大部分细胞和核酸，而SDT只能去除一部分核酸。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察结果显示OGP处理的猪心包表面结构和形态与天然猪心包类似，而SDS和SDT脱细胞处理的猪心包表面紊乱、纤维出现断裂。单轴拉伸测试结果表明OGP脱细胞处理能够保存基质材料中胶原纤维和弹性纤维的结构和形态，对其力学性能影响较小，进一步证明了组织学染色和SEM观察的结果。生物化学成分测定(胶原蛋白含量、弹性蛋白含量、氨基聚糖(glycosaminoglycan，GAG)含量和含水量的测定）结果表明OGP脱细胞处理对ECM成分影响较小，除了GAG含量显著降低外。体外细胞毒性检测和溶血性能检测结果表明，OGP处理的猪心包与天然猪心包有轻微的细胞毒性，溶血率较低。而SDS和SDT脱细胞处理的猪心包的细胞毒性级数为2级，有一定的毒性，且溶血率比天然猪心包的较高。本实验结果证明，1％ OGP脱细胞处理能够完全去除细胞且能较好地保存ECM的结构形态、力学性能和生化组成成分，同时脱细胞后的支架细胞毒性和溶血率低。
　　 综上所述，OGP这种新型的环保的可降解的去污剂是可以作为去细胞试剂，且浓度为1％时能够完全去除猪心包组织内的细胞和较好地保存ECM结构和成分，制备的ECM生物支架具有良好的生物相容性，为构建组织工程心脏瓣膜支架提供一种有效的途径。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 心脏瓣膜的发展现状

1．1．1 机械瓣与生物瓣

1．1．2 介入式人工生物瓣膜

1．1．3 组织工程心脏瓣膜与支架材料

1．2 心包材料的简介

1．2．1 心包的形态和组成结构

1．2．2 不同心包之间的差异及与瓣叶的比较

1．2．3 心包的纤维取向

1．2．4 心包的应用

1．3 天然组织的去细胞技术的研究最新进展

1．3．1 去细胞原理

1．3．2 常用的去细胞技术

1．3．3 去细胞的ECM支架的评价

1．3．4 去细胞与抗原去除

1．3．5 展望

1．4 本论文研究的内容与意义

1．4．1 课题的提出

1．4．2 研究内容与意义

1．5 创新点

第二章 心包的获取和不同浓度的OGP去细胞研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 实验仪器

2．2．3 相关溶液的配制

2．2．4 猪心包材料的获取

2．2．5 不同浓度的OGP去细胞效果研究

2．2．6 组织病理学染色观察

2．3 结果与讨论

2．3．1 心包的擦拭

2．3．2 不同浓度的OGP脱细胞的组织学评价

2．4 本章小结

第三章 OGP与SDS和SDT去细胞的比较研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 相关溶液的配制

3．2．4 猪心包材料的获取

3．2．5 OGP、SDS和SDT对猪心包进行去细胞处理

3．2．6 组织病理学染色观察

3．2．7 DNA含量测定

3．2．8 含水量测试

3．2．9 力学性能测试

3．2．10 SEM观察

3．2．11 胶原蛋白含量测定

3．2．12 GAG含量测定

3．2．13 弹性蛋白含量测定

3．2．14 统计学分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同去细胞方法的组织学评价

3．3．2 DNA含量的定量测定

3．3．3 扫描电镜观察

3．3．4 力学性能测定

3．3．5 含水量测定

3．3．6 胶原蛋白含量测定

3．3．7 弹性蛋白含量测定

3．3．8 GAG含量测定

3．4 本章小结

第四章 OGP去细胞制备的ECM支架的生物相容性评价

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂

4．2．2 实验仪器

4．2．3 相关溶液的配制

4．2．4 ECM支架材料的获取

4．2．5 体外细胞毒性测定

4．2．6 溶血性能测定

4．2．7 统计学分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 细胞毒性试验结果

4．3．2 溶血试验结果

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 实验结论

5．2 后续工作建议

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间科研及发表论文情况

致谢