过氧化物酶体增殖物激活受体γ对大鼠脊髓损伤神经保护作用及机制的实验研究

摘要

神经保护是指在神经损伤发生前或神经损伤早期采用药物治疗或某些处理措施将神经的损伤降低到最低程度的一种治疗策略。研究者致力于寻求新的神经保护治疗手段，以求改善脊髓损伤的预后。脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）后自身的修复能力非常有限，死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替.目前临床治疗主要是控制继发性损伤的进一步加重.如何有效地促进损伤脊髓的再生与修复一直是神经科学领域的难题。近年来神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的研究改变了这一观点，神经干细胞作为一种全能细胞能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经系统的各种成分，有效的促进脊髓的再生与修复。神经干细胞治疗脊髓损伤作为一种与传统有别的神经保护及修复的重要防治手段近年来己开始越来越多地引起人们的兴趣和关注，成为神经科学研究领域中的一个热点。研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）的激活能促进神经干细胞细胞的分化和成熟[1]，在中枢神经系统的损伤治疗方面治疗有良好的研究前景。目前PPARγ对脊髓损伤后神经保护的研究尚处于初级探索阶段。本实验采用SD大鼠脊髓打击损伤模型，探讨PPARγ在大鼠脊髓损伤后继发性损伤中的表达变化规律，及高压氧预处理对其表达变化的影响，观察PPARγ对脊髓损伤的神经保护效应，并对保护机制进行初步探讨，同时对高压氧及PPARγ激动剂联合治疗脊髓损伤的疗效给予评估。本文共分为以下四部分内容：
　　 一.PPARγ在大鼠脊髓损伤后继发性损伤中的表达变化规律及高压氧预处理对其表达变化的影响
　　 目的: 通过建立脊髓损伤和高压氧预处理脊髓损伤动物模型，观察PPARγ在大鼠脊髓损伤后继发性损伤中的表达变化规律，及高压氧预处理对其表达变化的影响。
　　 方法:1、高压氧预处理动物模型的建立. 2、脊髓损伤模型的建立：麻醉状态下，手术显露椎管及硬膜囊，用30g冲击棒自5cm高度自由落体下坠致伤脊髓。冲击棒下端直径3mm，致伤能量为150gcf，建立脊髓损伤模型。3、观察项目：PPARγmRNA和蛋白的定量观察。4、实验内容数据采用SPSS16.0软件进行统计学处理。
　　 结果:1、本实验高压氧预处理及大鼠脊髓打击伤模型建立可靠稳定，具有较好的可重复性。2、PPARγ在大鼠脊髓打击模型伤后1d表达即开始增加，为0.59±0.97，与对照组比较有统计学差异。3d至7d内表达明显增加，至14d时为本实验观察时间点的表达高峰，为2.05±0.31。28d时表达明显回落，与对照组比较已无统计学意义。3、高压氧预处理大鼠脊髓损伤后1d PPARγ表达与损伤组比较明显增加，有统计学差异，至14d时为本实验观察时间点的表达高峰，为3.19±0.67（p<0.01），至28天时已明显回落，但仍有统计学意义。
　　 结论: 1、大鼠打击SCI模型与人类SCI有一定相似性，个体差异不明显，模型制备简单，稳定重复性强，高压氧预处理模型与人类高压氧治疗具有一定相似性，可稳定重复。2、脊髓损伤后PPARγ表达明显增加，并能在较长时间内保持高表达。3、在本实验条件下，高压氧预处理明显促进了PPARγ的表达，高表达时间明显延长。
　　 二.PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经保护效应的实验研究
　　 目的： 观察PPARγ的激活对成年大鼠急性脊髓损伤后不同时期神经功能的影响，以探讨PPARγ对脊髓损伤后的神经保护效应。
　　 方法:1、成年清洁级雄性大鼠随机分为损伤组、罗格列酮（PPARγ激动剂）处理组、GW9662（PPARγ拮抗剂）处理组。2、建立脊髓损伤模型后药物干预组分别给予PPARγ激动剂或拮抗剂腹腔注射干预一周。3、观察项目：（1）行为学评价：采用BBB运动功能评分法，分别在脊髓损伤后1d、1w、2w、4w和8w进行评分。（2）诱发电位的测定：各组大鼠分别在脊髓损伤后不同时期测定体感诱发电位和运动诱发电位。（3）光镜下观察脊髓标本：各组大鼠脊髓分别在损伤后不同时期灌注固定取材，行脊髓冠状、矢状切片的HE、尼氏染色观察。（4）神经束路示踪：生物素化萄聚糖胺顺行示踪，观察上行和下行轴突再生情况，激动剂和拮抗剂对轴突再生的影响。 4、实验内容数据采用SPSS16.0软件进行统计处理。
　　 结果:1、本实验大鼠脊髓打击伤模型建立及腹腔注射干预法简便易行可靠稳定，具有较好的可重复性。 2、大鼠脊髓打击模型在伤后1d BBB评分为0分，1w为1.86±1.32分;3、运动诱发电位和体感诱发电位的潜伏期在脊髓损伤后明显延长. 4、光镜观察：脊髓损伤后1d可见，损伤区中央灰质出现大片出血、细胞肿胀、尼氏体消失，并有大量单核或多核炎性细胞浸润；5、脊髓损伤后1d时三组神经元尼氏体无变化，少量尼氏体染色不完整。1w时SCI组神经元及胶质细胞消失，软化灶形成，尼氏体有所减少。RT组神经元完整性及数量明显好于SCI组，尼氏体消失较少，而GT组神经元大量消失，尼氏体明显单染（见图2-7）。6、神经束路示踪显示：经罗格列酮干预后，下行示踪标志阳性纤维明显增多，胶质瘢痕明显减少，而经GW9662干预后下行示踪标志阳性纤维明显减少，胶质瘢痕明显增多。
　　 结论:罗格列酮干预后，大鼠在脊髓损伤后不同时期脊髓功能改善，运动诱发电位和体感诱发电位潜伏期缩短，病理变化减轻，残存尼氏体，神经束路示踪标志阳性纤维明显增多，提示对大鼠脊髓损伤有神经保护作用，而GW9662干预后结果相反，提示其阻碍了大鼠脊髓损伤的神经恢复。
　　 三、PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经保护作用机制的探讨
　　 目的:观察PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经保护作用机制，为脊髓损伤的防治提供理论基础。
　　 方法:脊髓打击伤实验动物模型建立分组后，在不同时期内取材，行免疫荧光染色，观察PPARγ对脊髓损伤后神经干细胞分化为神经前体细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元的影响。实验内容数据采用SPSS16.0软件进行统计处理。
　　 观察项目：1、新生神经前体细胞，Nestin+Brdu免疫荧光双标染色观察;2、新生少突胶质细胞，MBP+Brdu免疫荧光双标染色观察;3、新生星形胶质细胞，GFAP+Brdu免疫荧光双标染色观察;4、新生神经元细胞，NSE+Brdu免疫荧光双标染色观察.
　　 结果:1、单纯脊髓损伤1w，脊髓实质中即可见到少量的Nestin+Brdu免疫荧光双标阳性细胞，2 w后观察到大量的Nestin+Brdu免疫荧光双标阳性细胞，胞体为多角形或卵圆形，有较多突起; 2、SCI后3d，SCI组脊髓实质中即可见到少量的MBP+Brdu免疫荧光双标染色阳性的新生的少突胶质细胞，1w时，观察到大量的新生少突胶质细胞，2w后达到高峰。3、GFAP表达于正常脊髓的中央灰质和周围白质。损伤组：1d在损伤区周围增加，2w达到高峰，以脊髓中央管室管膜区表达最为明显。4、SCI组损伤后1d即见损伤周围少量新生神经元，而在损伤区无表达。伤后3d时RT组新生神经元表达明显增多，而GT组表达明显减少，与SCI组比较均有统计学差异。伤后2w时新生神经元表达达高峰，4w时新生神经元表达开始下降，三组间仍有统计学差异。
　　 结论:1、罗格列酮通过促进神经干细胞的分化起到神经保护作用，而GW9662抑制神经干细胞的分化，加重神经损伤。2、在脊髓损伤的早期（本实验观察到为4w之内），罗格列酮可以促进神经前体细胞的再生，起到保护神经元的作用，GW96622可抑制神经前体细胞活化。3、罗格列酮可以促进少突胶质细胞的产生（本实验观察到为4w之内），对神经传导的连续性具有保护作用，GW96622可抑制少突胶质细胞的产生，阻碍神经传导。4、在脊髓损伤的早期（本实验观察到为2w之内），罗格列酮可以促进新生星形胶质细胞产生，起到保护神经元的作用。5、罗格列酮可以促进新生神经元的产生（本实验观察到为4w之内），GW96622可抑制新生神经元的产生，阻碍脊髓损伤后的神经恢复。
　　 四、高压氧预处理及罗格列酮联合干预治疗实验性大鼠脊髓损伤的疗效评价
　　 目的:通过分组高压氧预处理大鼠脊髓损伤后PPARγ激动剂联合干预治疗，评估治疗效果，为脊髓损伤的治疗研究提供新的方法。
　　 方法:1、实验大鼠分为高压氧预处理脊髓损伤组、PPARγ激动剂治疗组，高压氧预处理后脊髓损伤PPARγ激动剂治疗组。2、观察项目：（1）行为学评价：采用BBB运动功能评分法，分别在脊髓损伤后1w、2w、4w和8w进行评分。（2）诱发电位的测定：各组大鼠分别在损伤后不同时期行体感诱发电位和运动诱发电位检测。3、实验内容数据采用SPSS16.0软件进行统计处理。
　　 结果:1、高压氧预处理及罗格列酮联合干预治疗组与其他两组比较，BBB评分明显增高，高压氧预处理脊髓损伤组和非预处理脊髓损伤PPARγ激动剂治疗组1w时分别为2.33±1.03分和3.67±1.36，8w为15.83±3.65分和17.17±2.48分，差异具有统计学意义（p<0.01）。2、运动诱发电位和体感诱发电位的潜伏期在脊髓损伤后明显延长，高压氧预处理及罗格列酮联合干预治疗组与其他两组相比较，潜伏期明显缩短，差异有显著性。
　　 结论:脊髓损伤前行高压氧氧预处理，损伤后立即行PPARγ激动剂治疗，对脊髓损伤后神经功能保护效应显著，是脊髓损伤防治的重要策略之一。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

前 言

第一部分 PPARγ在大鼠脊髓损伤后继发性损伤过程中的表达变化规律及高压氧预处理对其表达变化的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分 PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经保护效应的试验研究

材料与方法

结果

讨论

第三部分 PPARγ对大鼠脊髓损伤后神经保护作用机制的探讨

材料与方法

结果

讨论

第四部分 高压氧预处理及PPARγ受体激动剂联合干预治疗实验性大鼠脊髓损伤的疗效评价

材料与方法

结果

讨论

全文总结

附图表

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文