紫铆花素对大鼠急性脊髓损伤后的神经保护作用及其机制的实验研究

摘要

目的:
　　 脊髓损伤严重威胁人类健康，目前尚无有效的治疗手段。脊髓损伤分为原发性和继发性损伤。早期中断继发性损伤，可以改善脊髓组织的生存状况，为功能恢复保存必需的解剖结构，这代表了脊髓损伤治疗的一种潜在方向。炎症反应是继发性损伤的主要成分，在急性脊髓损伤的病理生理学机制中处于中心地位。脊髓损伤后的继发性炎症反应和凋亡在脊髓损伤后的神经功能的恢复中具有重要作用。紫铆花素是从传统中草药锦鸡儿中提取的主要活性成分，作为一种植物源性多酚类化合物，紫铆花素具有抗氧化、抗炎症等多种药理作用。紫铆花素是IKKβ的选择性抑制剂，可有效抑制NF-κ B的表达，减轻炎症反应。最近的研究表明，紫铆花素可以减少炎症基因表达从而保护小鼠海马神经元，但其在脊髓损伤中的作用效果尚未见报道。本研究拟建立大鼠急性脊髓损伤模型，采用硬膜下给药方式注射紫铆花素，通过对脊髓损伤后神经功能恢复，组织水肿、炎症细胞浸润及细胞凋亡情况，趋化因子、及凋亡相关蛋白的表达，以及IKK/NF-κB信号通路激活情况的观察，了解紫铆花素对脊髓损伤的治疗作用及其分子生物学机制，为紫铆花素在脊髓损伤中的应用提供理论基础和实验。
　　 方法:
　　 1、健康成年雌性SD大鼠，应用改良Allen法建立大鼠中度脊髓损伤模型，损伤位置在胸12椎体，损伤能量为25g*cm。
　　 2、将实验大鼠随机分成3组，分别为假手术组（仅切除椎板，不损伤脊髓），脊髓损伤组（损伤脊髓，给予1％的DMSO，50μ1/公斤体重）和紫铆花素治疗组（损伤脊髓，给予紫铆花素0.5mg/公斤体重）。
　　 3、给药方式:脊髓损伤后15分钟在损伤脊髓下方0.5cm处硬膜下穿刺，将药物或溶剂注射进入硬膜下腔脑脊液中。
　　 4、观测紫铆花素对脊髓损伤后大鼠后肢神经功恢复情况。在脊髓损伤后15分钟硬膜下注入相应药物，应用BBB评分评价脊髓损伤后1、7、14、21天后肢运动功能，应用CBS联合评分对脊髓损伤后1、7、14、21天大鼠后肢的脚趾伸展、触地反应、回缩反射、矫正反射以及肢体动作协调等方面功能进行评价。
　　 5、观测紫铆花素对大鼠急性脊髓损伤24hr后炎症细胞浸润和细胞凋亡的影响。在脊髓损伤后15min硬膜下注入相应药物，在脊髓损伤后24hr处死动物取1cm脊髓组织，应用于/湿重比检测组织水肿程度;应用免疫组织化学和免疫印迹分析检测脊髓损伤后组织中iNOS和Bax的表达;应用免疫印迹分析脊髓损伤后组织MCP-1、Caspase-3蛋白表达;应用MPO活性检测试剂盒检测脊髓标本中MPO活性;应用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测脊髓损伤后组织中细胞凋亡的情况。
　　 6、观测紫铆花素对大鼠急性脊髓损伤后IKK/NF-κB信号通路的影响。在脊髓损伤后15分钟硬膜下注入相应药物，在脊髓损伤后24小时处死动物取1cm长脊髓标本，应用光谱法定量检测损伤脊髓组织中IKKβ激酶活性，采用蛋白免疫印迹检测损伤脊髓组织中NF-κB及磷酸化I-κBα表达。
　　 结果:
　　 1、BBB评分显示:在脊髓损伤后第一天，脊髓损伤组和紫铆花素治疗组均表现出严重的后肢运动功能障碍，平均评分分别是1.2±0.25和1.1±0.14，与假手术组中的大鼠比较有显著性差异(p＜0.01);在脊髓损伤后14天，脊髓损伤组和紫铆花素治疗组之间出现了显著性差异(p＜0.05)，脊髓损伤组中的大鼠后肢仅仅显示出恢复了三关节（髋、膝、踝）的运动，平均分为6.6±0.42;而紫铆花素治疗组中大鼠后肢则显示出后肢足底处于负重位，可出现负重步行，平均得分为11.2±0.54。CBS评分系统对脊髓损伤后大鼠后肢的感觉及神经反射功能进行评价，在脊髓损伤后第一天，脊髓损伤组和紫铆花素治疗组均表现出严重的后肢感觉及神经反射功能障碍，与假手术组中的大鼠比较有显著性差异(p＜0.01。在损伤后21天，紫铆花素治疗组和脊髓损伤组之间存在显著性差异(p＜0.05)。脊髓损伤组大鼠仅获得相当于假手术组23.4％的评分，而紫铆花素治疗组的评分明显增加，达到假手术组52.7％。
　　 2、在脊髓损伤后24小时，损伤组中水肿程度和MPO活性、MCP-1和iNOS的表达较假手术组明显升高，紫铆花素治疗可以明显抑制它们的升高;脊髓损伤后凋亡阳性细胞数明显增加，紫铆花素治疗可以明显减少脊髓组织中细胞的凋亡。Westem blot方法显示:与假手术组中的大鼠相比较，脊髓损伤后大鼠脊髓中激活型caspase-3表达明显增加，紫铆花素治疗可以明显减少脊髓组织中激活型caspase-3的表达;脊髓损伤后Bax表达明显增加，紫铆花素治疗可以明显减少脊髓组织中Bax的表达。
　　 3、在脊髓损伤后24小时，同假手术组中的大鼠相比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织中的IKKβ激酶活性明显升高，为0.84±0.027单位/毫克，紫铆花素治疗可以明显抑制损伤后脊髓组织中IKKβ激酶活性的增高，两者有显著性差异(P＜0.05)。在术后24小时，假手术组中有少量磷酸化I-κBα蛋白;脊髓损伤组磷酸化I-κBα蛋白明显增高(P＜0.01);紫铆花素干预可以明显抑制磷酸化I-κBα蛋白表达的增高(P＜0.05);在脊髓损伤后24小时，与假手术组中大鼠相比较，脊髓损伤组中大鼠脊髓组织中NF-κB p65的表达明显增加(P＜0.01)，紫铆花素治疗可以明显抑制脊髓组织中NF-κB p65的表达(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1、紫铆花素改善急性脊髓损伤后后肢运动功能、感觉及神经反射的恢复，表明其对脊髓损伤具有治疗意义。
　　 2、伤后早期硬膜下注射紫铆花素治疗可以减轻急性脊髓损伤后的炎症细胞浸润和脊髓水肿程度，减少脊髓组织内的细胞凋亡数目;紫铆花素通过抑制MCP-1的表达来减少炎症细胞的浸润;紫铆花素可以明显抑制脊髓损伤后iNOS和caspase-3的激活，减少神经损害，保护神经功能;紫铆花素通过减少促凋亡蛋白Bax的表达来抑制凋亡，因而减少细胞的死亡，保护损伤脊髓的神经元。
　　 3、紫铆花素可以有效抑制性脊髓损伤导致的IKK/ NF-κB信号通路的激活，为其在脊髓损伤治疗中的应用提供了分子生物学基础。

目录

声明

摘要

第一部分 紫铆花素改善大鼠急性脊髓损伤后神经功能的实验研究

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1、紫铆花素改善急性脊髓损伤后后肢运动功能的恢复

2、紫铆花素改善急性脊髓损伤后后肢感觉及神经反射的恢复

讨论

小结

参考文献

第二部分 紫铆花素减轻大鼠急性脊髓损伤后炎症反应和凋亡的实验研究

前言

材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1、紫铆花素减轻急性损伤后脊髓组织的水肿

2、紫铆花素调节急性脊髓损伤后MCP-1的表达及中性粒细胞浸润

3、紫铆花素调节脊髓损伤后诱导型一氧化氮合成酶(inducible NO-synthase，iNOS)的表达

4、紫铆花素减少急性脊髓损伤后细胞的凋亡

5、紫铆花素抑制急性脊髓损伤后促凋亡基因Bax的表达

讨论

小结

附录

参考文献

第三部分 紫铆花素调节大鼠急性脊髓损伤后IKK／NF-κB信号通路的实验研究

前言

材料和方法

1、实验材料

2．实验方法

结果

1、紫铆花素抑制脊髓损伤后IKKβ激酶活性的增高

2、紫铆花素抑制脊髓损伤后磷酸化I-κBα蛋白表达

3、紫铆花素抑制脊髓损伤后NF-κB P65蛋白表达

讨论

小结

参考文献

本论文创新点的自我评价

综述

附录

个人简介

攻读学位期间发表文章

致谢