神经前体细胞体外诱导多巴胺能神经元和移植治疗帕金森病实验研究

摘要

该研究目的将大鼠胚胎中脑神经前体细胞在体外进行多巴胺能神经元的诱导,移植到脑内后可以分化为多巴胺能神经元分泌多巴胺神经递质,以达到治疗PD的目的.首先分离培养E14.5 SD大鼠胚胎中脑腹侧神经前体细胞,并进行传代;在体外对神经前体细胞行多巴胺能的诱导,使其有较高的比例具有向多巴胺能分化的潜能,然后在它们分化之前,移植到大鼠PD模型的纹状体内,观察经过这样处理的神经前体细胞,能否在体内存活,并分化为所需要的多巴胺能神经元.现摘要如下:第一部分;研究目的:对来源于E14.5 SD大鼠胚胎中脑腹侧的组织细胞,经过一系列分离操作后种植,探讨能否在体外长时间的培养并传代,传代后的细胞在同样条件下继续培养是否仍保持母细胞的形态及其它细胞特点;对这些细胞进行神经干细胞特性的鉴定,是否具有后者的所有特性.方法:辨别并分离E14.5 SD大鼠胚胎中脑腹侧组织细胞,以×10<'6>/ml密度种植,在没有血清的限定培养基内培养,并含有bFGF.神经球增大到150μm左右后轻轻吹散,使之成为单细胞悬液,并给予传代.对经过传代的细胞,进行nestin的免疫组化检测,同时进行BrdU增殖实验;在所培养的细胞分化前和分化后,都进行NSE和GFAP免疫组化染色,它们分别是神经元和神经胶质细胞的特异性表面标志.结论:来源于E14.5大鼠胚胎中脑腹侧的神经前体细胞,可以在体外无血清培养基内长时间生长、分裂和传代,传代后的细胞仍保持神经干细胞的特性.bFGF对神经前体细胞得分裂起关键作用.经过鉴定,所培养的细胞符合神经干细胞的定义,即未分化、能够自我更新和复制、具有多能性.第二部分;研究目的:来源于E14.5 SD大鼠胚胎中脑腹侧的神经前体细胞,在体外培养并传代后,与一系列造血系统细胞因子和其它诱导条件共同孵育,观察其能否提高分化多巴胺神经元的比例;以及经过这样诱导的神经前体细胞,其子代细胞的形态发育与不同诱导条件有什么关系.方法:制备纹状体条件培养基和中脑膜裂解碎片;对经过传代的大鼠胚胎中脑神经前体细胞,与造血系统细胞因子和自己制备纹状体条件培养基、中脑膜裂解碎片共同孵育,细胞因子包括IL-1μ、GDNF、LIF.这5种诱导条件按不同组合分别与神经前体细胞孵育,然后在后者分化后行TH免疫组化染色,观察阳性细胞的数目及形态.经过所有诱导条件联合孵育的神经前体细胞,分化后行Western Blot实验.结论:来源于E14.5大鼠胚胎中脑腹侧的神经前体细胞,可以在体外无血清培养基内长时间生长、分裂和传代,传代后的细胞仍保持神经干细胞的特性.bFGF对神经前体细胞得分裂直关键作用.经过鉴定,所培养的细胞符合神经干细胞的定义,即未分化、能够自我更新和复制、具有多能性.第三部分;研究目的:经过多巴胺能诱导的大鼠胚胎中脑神经前体细胞,在没有分化为终末神经元之前,移植到SD大鼠PD模型脑纹体的壳核.检测经过上述处理的神经前体细胞能否在宿主脑内存活,并分化为多巴胺能神经元细胞.方法:应用6-OHDA对出生4~5月的SD大鼠行SNc和VTA两点注射,制作PD的动物模型.在移植之前,注射美蓝作预实验以确认移植部位的精确性.经过IL-1α、GDNF、LIF、纹状体条件培养基和中脑膜裂解碎片联合孵育的神经前体细胞,一部分作BrdU的标记,另一部分不做标记,分别移植到PD动物模型的纹状体壳核.在移植后1、2和4周处死动物作脑切片,移植BrdU标记细胞的作BrdU免疫组化染色,诱导后直接移植的作TH免疫组化染色.结论:应用6-OHDA对大鼠SNc和VTA两点注射的方法,能够成功模仿人类PD症状的动物模型,因而在这样的模型进行的动物实验是有意义的.预实验证实应用这种移植方面可以保证移植位置的准确.经过IL-1α、GDNF、LIF、纹状体条件培养基和中脑膜裂解碎片联合诱导的中脑神经前体细胞,移植到PD模型壳核后能够存活,并且远较不经诱导直接移植分化多巴胺能神经元数量多,表明在体外对中脑神经前体细胞进行多巴胺能表型的诱导,对于移植治疗PD是有意义的.

目录

英文缩略语表

前言

第一部分神经前体细胞的分离、培养和鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分神经前体细胞体外诱导多巴胺能神经元研究

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分经多巴胺能诱导的神经前体细胞移植治疗PD实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

致谢

综述细胞移植治疗中枢神经系统疾病进展

前言

一成年大脑细胞移植特点

二细胞来源

三细胞移植在CNS疾病中的应用

四细胞移植临床试验的可行性

五前景

参考文献