人脐血源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的实验研究

摘要

第1章人脐血间充质干细胞的分离培养和鉴定。 目的：对HUCB-MSCs进行分离、纯化、培养和鉴定，为后续研究提供基础。 材料与方法： 1.人脐血单个核细胞(Mononuclear Cells，MNCs)的分离、传代无菌条件下采集脐血、沉降、离心后分离MNCs，以1×10<'7>密度接种后以含L-DMEM的完全培养基贴壁培养，待细胞融合达80-90﹪，进行传代、扩增培养。 2.MSCs增殖能力的鉴定取融合达90﹪的MSCs，消化、制备成细胞悬液后接种，并依次于培养第1天至第9天消化细胞并计数，绘制成生长曲线，检测增殖能力。 3.MSCs表面标志的检测将MSCs制备成细胞悬液，加入FITC或PE标记的抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD106和CD166抗体，应用FACScan流式细胞仪分析样本中相应标记抗原的阳性表达率。 结果： 1.HUCB-MSCs的分离培养由脐血成功分离MNCs，接种后细胞贴壁良好并形成集落，原代5-7天后贴壁、增殖潜伏期7-10天，2-3周为细胞的快速增殖期，3-4周左右即达完全融合，各期细胞形态与原代无明显差别。 2.HUCB-MSCs增殖能力的鉴定传代的细胞较原代细胞增殖速度明显增快，1-3天为潜伏期，3-7天是细胞快速增殖期，9天后速度减慢进入平台期。随着传代次数的增加，细胞增殖速度稍逐渐下降。 3.HUCB-MSCs表面标志的检测流式细胞仪结果显示，HUCB-MSCs易纯化，P3代细胞均一性达90﹪以上。MSCs表面标志CD29、CD44、CD105和CD166均为阳性，造血细胞表面标志CD34、CD45为阴性。 结论：成功分离纯化并扩增出HUCB-MSCs，为下一步的实验提供了种子细胞。 第2章Nurrl基因转染人脐血间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元。 目的：观察外源性Nurr1基因在HUCB-MSCs的表达，及在FGF8和Shh诱导下对其分化为多巴胺能神经元的影响。 方法： 1.采用脂质体法将pcDNA3.1-Nurr1转染HUCB-MSCs，Westem blot观察Nurr1基因表达情况； 2.MTT法检测载体转染对细胞活性的影响； 3.HUCB-MSCs被随机分为A组(对照组)、B组(Nurr1组)、C组(FGF8+Shh组)及D组(Nurr1+FGF8+Shh)，并在神经细胞条件培养液中进行增殖培养和诱导分化，间接免疫荧光染色法及免疫细胞化学染色法鉴定细胞性质，高效液相色谱法测定多巴胺含量。 结果： 1.Westernblot结果显示转染后Nurr1蛋白表达明显增高。 2.MTT法检测结果显示：各组细胞的OD492值差别无统计学意义，提示真核表达载体pcDNA3.1-Nurr1及空质粒pcDNA3.1转染脐血MSCs，对细胞活性无明显影响。 3.A组和B组未发现TH阳性细胞，而C组和D组TH阳性细胞分别为10.12﹪及25.36﹪，多巴胺含量分别为43.6nmol/L及83.2nmol/L，均有显著性差异(P<0.01)。 结论：HUCB-MSCs在FGF8和Shh诱导下可以分化为多巴胺能神经元，外源性Nurr1基因修饰后，分化为多巴胺能神经元的数量增加。 第3章Nurr1基因修饰的HUCB-MSCs源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的作用。 目的：观察Nurr1基因修饰HUCB-MSC源性的多巴胺能神经元移植对PD模型鼠的治疗作用。 材料与方法： 1.构建SD大鼠PD模型，并将其随机分为对照组(A组)、单纯移植组(B组)、基因修饰组(C组)； 2.采用CFSE标记待移植的多巴胺能神经元； 3.HUCB-MSCs源性DA能神经元以一点定位注射法移植入毁损侧纹状体，对移植后的PD模型鼠进行行为学检测； 4.行荧光示踪实验，于荧光显微镜下观察移植细胞； 5.制备鼠脑冰冻切片，以免疫荧光化学染色法检测移植细胞TH表达，并采用激光共聚焦显微镜对其荧光强度行半定量测定； 6.采用HPLC方法检测及脑内多巴胺含量。 结果： 1.采用黑质纹状体纤维投射终末区(即纹状体区)两点注射6-OHDA的方法成功构建SD大鼠PD模型，成功率约为70﹪ 2.行为学结果B、C两组在移植后2w、4w和8w时其旋转行为均较A组有所改善(P<0.01)，且B、C组间比较C组改善明显，差异有统计学意义(P<0.01)，这种差异以第8w时最为明显(P<0.01)。 3.荧光示踪观察纹状体区可见CFSE标记的HUCB-MSCs源性的多巴胺能神经元呈翠绿色，移植2w后绿色细胞主要集中在注射针道附近，到第4w时细胞已有部分移行至远离细胞注射部位，第8w时这种迁移现象最为明显。此外，移植后2w时B组与C组的移植细胞无明显差别，但在4w、8w时，B组脑内存留的绿色细胞己明显较C组为少。 4.TH免疫荧光化学检测B组和C组的CFSE/cy3双染阳性细胞随移植时间的延长而减少，在移植后2w、4w、8w时，两组比较发现C组的双染阳性细胞数远较B组为多，差异有显著性(P<0.01)。在移植后2w、4w、8w，B组和C组ey3阳性细胞均较A组明显增多(P<0.01)，而C组又较B组多(P<0.01)，且随着移植后时间的延长差异日渐明显。激光共聚焦显微镜对阳性细胞荧光强度检测结果与此一致。 5.HPLC检测多巴胺含量B、C两组脑内DA含量较A组明显增高(P<0.05)，移植2w后C组和B组差异不明显，4w后C组比B组含量高(P<0.05)，而这种差异在移植后8W时达到最大，但C组在移植后8w时，其脑内DA含量仍较健康大鼠低(P<0.05)。 结论：Nurr1基因修饰HUCB-MSCs来源的DA能神经元移植治疗PD模型，能有效地改善PD模型鼠的症状，提高移植后DA能神经元的整合及存活能力，保护了毁损纹状体内残存的DA能神经元。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第1章人脐血间充质干细胞的分离培养和鉴定

1材料

2实验方法

3结果

4讨论

5结论

第2章Nurr1基因转染人脐血间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元

1材料

2实验方法

3结果

4讨论

5结论

第3章Nurr1基因修饰的HUCB-MSCs源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病的作用

1实验材料

2实验方法

3结果

4讨论

5结论

全文结论

参考文献

附 图

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