诺如病毒荧光定量检测方法的建立及氯灭活诺如病毒消毒规律研究

摘要

研究目的:
　　诺如病毒(Norovirus,NoV)是一种引起世界范围内非细菌性急性胃肠炎的主要病毒,是杯状病毒家族的主要成员,能够引起急性腹泻、呕吐的发生,重者可因脱水死亡或自身免疫缺陷导致严重的并发症危及生命。从二十世纪九十年代至今,NoVGII.4已经逐渐成为了世界范围内的优势流行株,并且造成了至少四次全球性的疾病流行。NoV主要通过粪口途径传播,食用被病毒污染的食物、人与人的接触、食用牡蛎、饮水都可以传播该病毒,其次通过呼吸道吸入飞扬的呕吐物微粒也可能是一种传播途径。诺如病毒在环境中高度稳定,但是对人却极易感染,因此也是污染饮用水导致腹泻疾病流行的重要病因。上个世纪七十年代,通过电镜发现了NoV,目前,由于缺乏组织细胞培养系统,对于NoV的消毒机理的研究通常采用替代病毒来进行,例如:鼠NoV(murinenorovirus,MNV)、猫杯状病毒(felinecalicivirus,FeCV)和犬杯状病毒(caninecalicivirus,CaCV)。因此,调查研究我国NoV的流行现况,建立快速、准确的检测方法,为制定相应的控制策略和措施提供依据;对该病毒进行消毒研究,可以更好地提供污水消毒指导方案,进一步保证在污水净化过程中的细菌学和病毒学安全指标的达成。因此,本课题通过RT-PCR方法研究2009年10～11月天津市儿童医院的腹泻婴幼儿NoV的流行情况,建立和评价NoV基因II型的荧光定量RT-qPCR检测方法,采用氯对水中NoV的消毒进行初步研究,为污水中NoV的污染检测、消毒控制和突发公共卫生事件的快速检测提供参考方法和依据。
　　研究方法:
　　收集天津市2009年10～11月儿童医院门诊部和住院部急性腹泻患儿粪便标本319例,其中男198例、女121例,最小年龄为出生后两天,最大为9岁。通过RT-PCR方法确定NoV核酸阳性的标本,将PCR扩增样本交由公司纯化测序,样本序列结果经过编辑与Genbank中公布的基因进行Blast序列比较,从而判断样本的基因型。根据文献报道,从Genbank下载NoV各型参考株序列。应用Bioedit软件进行核苷酸多序列分析比对,利用MEGA4.1软件邻位相连法绘制系统发生树。采用统计学方法分析样本的人口学资料和临床资料。
　　采用RT-PCR检测NoVGII强阳性的样本,PCR产物纯化后克隆转化,蓝白斑阳性克隆筛选,构建质粒,并转录合成copyRNA(cRNA)作为标准品,建立和优化了NoV基因II型荧光定量RT-qPCR方法和反应体系,制作标准曲线,评价该反应体系的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测评价。
　　以NoV为研究对象,采用不同浓度的氯(1mg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、10mg/L)消毒剂处理水中的NoV,使用三对引物对NoV的灭活情况进行评价,其中自行设计分别针对NoV的5’端、3’端的引物,以及ORF1-ORF2结合区的引物参照文献(见第一章)。PH7.2,室温下,不同时间点取样,通过RT-PCR探索氯对NoV基因损伤位点,采用荧光定量PCR方法进一步检测氯消毒过程中NoV的核酸减少量。初步研究氯对NoV的灭活情况。
　　研究结果:
　　一、2009年10～11月天津市儿童医院腹泻患儿粪便标本中NoV的检出情况
　　经过RT-PCR检测的319例标本中,共检出60例NoV阳性。RT-PCR检测表明,有59例为NoVGII型,有1例为NoVGI型,构成比分别为98.3％和1.7%。
　　24例NoV阳性标本PCR产物纯化和测序,测序结果利用bioedit编辑后提交Genbank进行BLAST比对发现,1例是NoVGI型,其余的23例均为NoVGII型。
　　多序列同源性比对发现,测序毒株17株与荷兰的Nijmegen115参考株、LincolnHouse参考株、Beijing151株和Terneuzen70株序列同源性为71.7～99.3%,与LincolnHouse参考株同源性高达98.0～99.3%。15例GII-4型中13例是2006b变异株;2例是GII-3型。系统发生树分析显示,2009年天津市腹泻患儿NoV以NoVGII/2006b毒株为主要的流行株,这与我国其他地方目前的研究相似,这表明,目前我国的流行优势株仍然是NoVGII/2006b毒株。
　　不同年龄组NoV阳性的病例分布情况分析表明,60例感染患儿中,0～1岁年龄组的患儿感染NoV35例,1～2岁患儿感染NoV16例,随着年龄的增大,腹泻患儿减少,感染NoV的儿童也较少。婴幼儿NoV的感染主要是集中于0～2岁人群。
　　本研究中门诊腹泻患儿NoV的阳性率是26.75%(41/157),而住院部腹泻患儿NoV的阳性率是11.11%(18/162),统计学分析二者差别有统计学意义,说明该病发病急,自限性,恢复快,大多数病人选择门诊就医。
　　二、NoV基因II型荧光定量RT-PCR检测方法的建立和评估
　　NoVGII荧光定量RT-PCR扩增所使用的引物进行普通RT-PCR反应,2%的琼脂糖凝胶电泳显示,在98bp处有特异性条带,没有其他非特异性扩增。该引物和探针荧光定量RT-PCR检测荧光扩增曲线呈典型的光滑的S型曲线。
　　构建的质粒DNA的纯度好,浓度高,经过体外转录纯化得到cRNA,cRNA的OD值位于1.7～2.0中间,纯度较好,浓度均值为321.83μg/ml。标准曲线的斜率是-3.41,截距是49.79,相关系数(R2)是0.998。
　　此方法经过灵敏度检测,结果显示敏感性好,最低可以检出102拷贝数/μl的已知浓度RNA标准品样本。
　　此方法能够特异地检出NoV基因II型,与NoVGI型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应。
　　针对标准品的批内试验的Ct值变异系数(CV)分别为1.60%、0.70%,批间试验的变异系数(CV值)分别为0.40%、0.40%,均在5%以下,说明该体系稳定,重复性良好。
　　三、氯对水中NoV的消毒研究
　　RT-PCR结果显示,NV3R/NV3F引物对扩增条带最先消失;其次,随着氯的消毒剂量增大,COG2F/G2-SKR引物对扩增条带消失;而后,当氯的消毒剂量从5mg/L到10mg/L时,NV5R/NV5F引物对扩增条带消失。由此,我们认为,在三个不同的扩增中,消毒剂液氯可能优先损伤了NoV核酸的3’端,之后是ORF1与ORF2的结合区,而后损伤了5’端。
　　PH7.2,室温下,浓度为1mg/L的氯作用下,基于引物COG2F/G2-SKR的荧光定量PCR检测显示,NoV的减少率在20min达到2.16log10。随着氯浓度的增加,在氯浓度5mg/L的时候NoV的减少率在5min可达到2.24log10,在20min达到3.01log10。
　　结论:
　　1、2009年10～11月天津市儿童医院腹泻患儿中存在NoV所致的病毒性腹泻,并且NoV是导致腹泻的主要病原体;腹泻患儿存在不同基因型别的NoV感染,NoVGII-4的2006b变异株是主要的流行优势株。
　　2、我们建立和优化了荧光定量RT-PCR检测NoVGII型的方法,该方法稳定、灵敏性、特异性和重复性良好,可用于突发公共卫生事件的快速检测。
　　3、在NoV核酸的3’端、ORF1和ORF2的结合区和5’端三个不同的区域中,消毒剂液氯可能先损伤NoV的3’端,之后是ORF1和ORF2的结合区,随着氯的浓度增大时,损伤了NoV的5’端。随着氯使用浓度的增加,NoV的核酸减少率也在增加。

目录

封面

声明

目录

缩 略 词 表

中文摘要

英文摘要

前言

1 研究背景

2 课题研究思路和方法

第一章 2009年10~11月天津市儿童医院腹泻患儿粪便标本诺如病毒的检出情况分析

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第五节 结论

第二章 诺如病毒基因II型实时定量RT-PCR检测方法的建立

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

第三章 氯对水中人类诺如病毒的消毒研究

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 结果

第四节 讨论

第五节 结论

讨 论

参考文献

综述

发表文章

个 人 简 历

致谢