福州地区儿童诺如病毒基因型别分析及GII群诺如病毒捕获ELISA法的初步建立

摘要

目的：了解2009～2016年福州地区5岁以下急性腹泻住院儿童诺如病毒感染的基因型别并初步建立用于GII基因群诺如病毒检测的捕获ELISA法。
　　方法：（1）采用系统抽样的方法随机选取2009～2016年福州市儿童医院以及平潭县医院因急性腹泻入院，经Real-time RT-PCR筛选为诺如病毒核酸阳性的118份5岁以下儿童粪便标本，应用RT-PCR方法扩增完整VP1和部分RdRp区并测序；应用在线基因分型、种系进化以及基因重组分析诺如病毒的基因型别及动态变化。（2）选择一株有代表性的GII.4基因型Sydney_2012变种诺如病毒，利用大肠杆菌原核表达系统，体外表达诺如病毒VP1结构蛋白的P区多肽，包涵体经初步纯化、尿素溶解、PBS透析等进行蛋白纯化和复性，并进一步尝试形成病毒样颗粒（virus like particles,VLPs）。应用ELISA法检测可溶性重组P蛋白的抗原活性，透射电镜观察VLPs。（3）具有抗原活性的可溶性重组P蛋白免疫6周龄的BALB/c小鼠，经细胞融合，有限稀释法进行亚克隆和间接ELISA筛选，获得抗重组P蛋白的单克隆抗体细胞株；利用上述细胞株，制备鼠单克隆抗体腹水并经Protein G柱纯化；采用改良的过碘酸钠法对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶标记，利用抗重组P蛋白鼠单克隆抗体，初步建立检测GII基因群诺如病毒的捕获ELISA法；与Real-time RT-PCR比较，评价该方法的灵敏度和特异度；与进口同类商品化试剂比较，评价两种方法的符合率。
　　结果：（1）在118份诺如病毒核酸阳性粪便标本中，共获得93份完整VP1和部分RdRp区双基因序列，经测序均为GII基因群。其中GII.P4_GII.4基因型2006b变种41份，GII.Pe_GII.4基因型Sydney_2012变种31份，GII.P12_GII.3基因型13份，GII.P4_GII.4基因型New Orleans2009变种和GII.P17_GII.17基因型各2份，GI.Pa_GII.4基因型2006b变种、GII.P7_GII.7、GII.P7_GII.6和GII.P21_GII.3基因型各1份。（2）GII.4基因型Sydney_2012变种诺如病毒重组P蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经4mol/L尿素溶解、PBS透析复性后，可获得较强抗原活性的可溶性重组P蛋白，并能自组装成直径大小约为10～20nm的病毒样颗粒。（3）成功地获得2株能分泌抗重组P蛋白的鼠单克隆抗体细胞株，分别为212-1和46-2。2株单克隆抗体的效价分别为1：102400（212-1，IgG）和1：16000（46-2，IgM）。以212-1株单克隆抗体为材料初步建立捕获ELISA法，检测32份诺如病毒核酸阳性和30份阴性粪便标本，与Real-time RT-PCR法比较，其灵敏度和特异度分别为50%和100%；与进口商品化同类ELISA相比，两种方法的符合率为79.03%。
　　结论：（1）2009～2012年、2013～2016年福州地区5岁以下急性腹泻住院儿童诺如病毒感染分别以GII.P4_GII.4基因型2006b变种、GII.Pe_GII.4基因型Sydney_2012变种为主。（2）成功表达具有抗原活性的GII.4基因型诺如病毒P区重组多肽，初步建立了GII基因群诺如病毒双抗夹心ELISA检测方法，为今后进一步研制质量较高、便于基层现场使用的商业化试剂盒奠定了基础。

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