血管内皮生长因子基因治疗扩展大鼠腹壁轴型皮瓣切取范围的实验研究

摘要

目的：通过对比皮下注射血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因和外科延迟两种方法改善大鼠腹壁超范围轴型皮瓣成活的效果，综合两种不同途径，探索二者的联合应用扩展大鼠腹壁轴型皮瓣的切取范围。方法：以Wistar大鼠为实验模型制作以右侧腹壁浅动脉为血管蒂的轴型皮瓣，并分别采用皮下注射pcDNA4-VEGF165(术前或术时)、外科延迟及联合应用两种方法。皮瓣掀起7天后，①测定各组大鼠皮瓣的成活率；②取大鼠皮瓣组织标本行常规HE染色检测平均微血管数目及内径；③取皮瓣组织标本行VEGF免疫组化染色检测VEGF的表达情况，各试验组与空白组相对比，各试验组之间两两对比。结果：各试验组的皮瓣成活率明显高于空白组，组Ⅴ(延迟同时基因治疗组)的皮瓣成活率明显高于其他试验组；基因治疗组及联合应用组的平均微血管数目明显高于延迟组及空白组；平均微血管内径：延迟组＞联合应用组＞基因治疗组＞空白组；免疫组化染色显示基因治疗组及联合应用组VEGF染色深度明显高于空白组及单纯延迟组。结论：皮下注射pcDNA4-VEGF165及外科延迟两种方法均能有效地改善大鼠皮瓣的成活，但其作用机制不同，而延迟的同时皮下注射VEGF基因则能进一步地提高大鼠皮瓣的成活率，从而扩展皮瓣的切取范围。 目的：通过对比皮下注射血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因和外科延迟两种方法改善大鼠腹壁超范围轴型皮瓣成活的效果，综合两种不同途径，探索二者的联合应用扩展大鼠腹壁轴型皮瓣的切取范围。 方法： 1.构建血管内皮生长因子的真核表达基因-pcDNA4-VEGF165，经测序验证后通过碱裂解法大量制备质粒，PEG8000纯化，并经酶切鉴定和紫外分光定量。 2.pcDNA4-VEGFl65表达的检测：wistar大鼠腹部注射制备的pcDNA4-VEGF165质粒500μg，3天及7天后分别切取注射部位及未注射部位皮肤肉膜组织进行组织学检查及VEGF免疫组化染色。 3.以Wistar大鼠为实验动物制作以右侧腹壁浅动脉为血管蒂的8×8cm超范围轴型皮瓣。48只大鼠随机分为6组(每组8只)： ①组Ⅰ(空白对照组)：术前术时不做任何处理； ②组Ⅱ(术时基因治疗组)：皮瓣掀起的同时皮瓣区域内分10点(均匀分布)皮下注射VEGF基因500μg(500μl)，每点50μg； ③组Ⅲ(术前基因治疗组)：术前于皮瓣区域内皮下注射VEGF基因(注射点及剂量同组Ⅱ)，注射7天后掀起皮瓣； ④组Ⅳ(单纯延迟组)：采用两极双蒂皮瓣延迟法，第一次手术先切开皮瓣两侧，作肌膜上分离，使皮瓣仅在远近端切口处与身体相连，皮瓣下放置与皮瓣等大的医用硅胶膜并与皮瓣缝合固定，硅胶膜边缘恰好与皮肤相齐，以阻断皮瓣与受床及周围皮肤建立血运。延迟7天后完全掀起皮瓣； ⑤组Ⅴ(延迟同时基因治疗组)：皮瓣延迟的同时皮下注射VEGF基因(注射点及剂量同上)，延迟7天后完全掀起皮瓣； ⑥组Ⅵ(延迟后基因治疗组)：延迟结束掀起皮瓣时皮下注射VEGF基因(注射点及剂量同上)； 所有的皮瓣完全掀起后原位缝合。3、检测指标：皮瓣原位缝合7天后，处死实验动物①测定各组大鼠皮瓣的成活率：用透明纸描绘皮瓣成活及坏死区域，称量纸复录，电子分析天平称重，以重量比表示面积比，计算皮瓣成活率(皮瓣成活率=皮瓣成活面积/皮瓣成活面积+坏死面积×100％)。 ②取大鼠皮瓣组织标本行常规HE染色，观察组织学改变并检测平均微血管数目及内径，各组取平均数。 ③取皮瓣组织标本行VEGF免疫组化染色(SP法)检测VEGF的表达情况。 ④角膜组织学检查：摘取动物眼球，切取角膜组织切片，显微镜下观察角膜是否有新生血管。 4.统计分析：六组实验数据输入SPSS12.0统计学软件，采用单因素的方差分析方法进行数据的统计学分析处理，并做各组均数的两两比较(LSD-t检验和Student-Newman-Keuls检验)。 结果： 1.大鼠腹部皮下注射pcDNA4-VEGF165后，皮下组织内新生血管明显增多，免疫组化染色可见毛细血管内皮细胞胞浆中有VEGF抗原抗体复合物的沉积，未注射部位未见新生血管形成及VEGF的沉积。 2.皮瓣成活率：各试验组的皮瓣成活率明显高于空白组(P＜0.05)，组Ⅴ(延迟同时基因治疗组)的皮瓣成活率明显高于其他试验组(P＜0.05)；其余各实验组(组Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ)之间无显著性差异(P＞005)。 3.平均微血管数目：对照组与组Ⅳ(单纯延迟组)之间无显著性差异(P＞005)，其余实验组(组Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ)均显著高于对照组与组Ⅳ(P＜005)，组Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ之间无显著性差异(P＞005)。 4.平均微血管内径：单纯延迟组＞联合应用组(组Ⅴ、Ⅵ)＞基因治疗组(组Ⅱ、Ⅲ)＞空白组(P＜0.05)； 5.免疫组化染色显示基因治疗组及联合应用组(组Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ)毛细血管内皮细胞胞浆内有棕褐色的VEGF抗原抗体复合物的沉积，部分沉积物呈带状围绕血管腔，其染色深度明显高于空白组及单纯延迟组； 6.各组实验动物角膜层均未见新生血管。 结论： 1.大鼠腹部皮下注射pcDNA4-VEGF165能在局部表达丰富的血管内皮生长因子，其生物学效应为促进新生血管的形成； 2.皮下注射pcDNA4-VEGF165及外科延迟两种方法均能有效地改善大鼠腹壁超范围皮瓣的成活，两者效应相同但其作用机制不同。 3.皮瓣延迟的同时皮下注射VEGF基因相对单纯应用两种方法能进一步地改善大鼠腹壁超范围轴型皮瓣的成活从而可以扩展皮瓣的切取范围。 4.腹部皮下注射VEGF基因不会引起大鼠角膜新生血管的增生；

目录

文摘

英文文摘

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

应用前景

参考文献

插图

综述一 有关血管内皮生长因子的研究及其基因治疗在皮瓣组织修复中的应用

综述二皮瓣延迟的研究概况

致谢