包埋蛋白质药物注射用多孔微球支架的研究

摘要

组织工程支架的功能是为细胞的增殖提供三维空间和新陈代谢环境，并决定新生组织、器官的形状和大小。生长因子则诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活和促进组织再生。生长因子类药物大剂量全身给药虽然可以达到一定作用，但同时可以导致严重的副作用，甚至致癌。且局部虽可大剂量给药，但由于生长因子多为多肽蛋白类药物，存在半衰期短等原因引起的不稳定性。因此很多组织工程支架都加入生长因子类药物来刺激诱导细胞的生长或达到某种辅助治疗效果。实现生长因子在细胞支架中的可控制释放成为组织工程成功的关键之一。而目前蛋白质、多肽类药物的控缓释给药多采用微球载体形式，本研究结合微球制剂的制备技术工艺以及注射给药方便易行的优点，采用发泡法制备了一种包埋蛋白质药物注射用多孔微球作为组织工程支架。改进了传统组织工程支架需手术植入的不便，且可使药物以一定速率缓慢释放，提高细胞在支架中生长、分裂增殖的成功率和植入病变部位的便利性。 本文首先研究了以牛血清白蛋白(BSA)作为模型药物采用复乳发泡法制备注射用多孔PL,GA含药微球支架的制备工艺及其影响因素。通过单因素实验设计考察了制备复乳的搅拌速度、分散相聚乙烯醇(PVA)浓度、油相PLGA浓度、制备初乳时内水相与油相体积比、均质乳化速度以及发泡剂浓度等因素对微球形态、平均粒径、表面孔径大小、空隙率的影响。结果表明油相PLGA浓度、制备初乳时内水相与油相比、发泡剂浓度、均质乳化速度为其主要影响因素。针对主要影响因素用正交设计、星点设计优化处方工艺。通过处方和工艺设计调控微孔大小和药物在复合支架中的释放，最后得到的优化处方微球支架平均粒径为451μm，表面孔穴平均孔径为20.3μm，包封率为60.08％，30天累计释放可达84％。 以BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)分析法测定释放介质中的BSA的浓度，考察了微球的30天体外释放特性，体外释放符合Riger-Peppas模型。为了考察多孔微球支架制备工艺对模型药物BSA稳定性的影响，我们采用不同溶剂溶解残存蛋白，分别测定其30天后未释放完全的非聚集蛋白含量、以非共加键聚集以及二硫键结合的变性蛋白含量。优选微球支架体外释放30天后残余蛋白的测定结果表明，残留非聚集蛋白含量约为10％，以非共价结合的聚集蛋白占总体蛋白含量2％以下，以二硫键结合蛋白含量占总体蛋白含量1％以下。 制备方法简便易行，且对蛋白活性影响不大。进行NIH 3T3成纤维细胞与微球支架的共培养实验，通过荧光染色观察细胞在支架中的种植和分裂增殖状态，并同时进行未经染色处理的微球支架共聚焦显微镜观察，作为荧光染色效果空白对比。细胞荧光染色后的共聚焦显微观察结果发现3T3细胞能较好的吸附和种植到支架表面和孔穴中，共培养一周后微球支架上细胞生长状态良好，经过七天的培养分化增殖，贴壁细胞不但可以继续牢固的在微球支架表面生长附着，而且通过微球支架的表面孔径进入微球内表层的细胞也可以进一步生长。 结果表明复乳发泡法制备的微球可以用作组织工程细胞载体支架，具有较好的开发应用前景。 结论：获得了既能载荷细胞又能缓慢释放蛋白类药物的可注射多孔细胞微球支架，用以满足不同组织工程的需要。

目录

声明

摘要

前言

第一章 微球支架中药物含量测定方法的建立及初步稳定性研究

一、材料和仪器

1.仪器

2.试药

二、方法与结果

1.牛血清白蛋白BSA微球支架含量测定方法的建立

2.微球载药量和包封率的测定

3.微球的体外释放实验

4.体外释放30天后微球支架中各种残存蛋白分类定量分析方法的建立

三、小结与讨论

第二章复乳法制备微球支架制备工艺研究

一、材料和仪器

1.仪器

2.试药

二、方法与结果

1.包埋BSA的PLGA微球支架的制备

2.复乳发泡法制备BSA微球支架处方工艺对空白微球表观形态影响的单因素考察

3.正交设计

4.星点设计

三、小结与讨论

第三章多孔微球支架的药剂学性质研究

一、材料与仪器

1.仪器

2.试药

二、实验方法

1.微球支架的形态学考察

2.微球支架的粒径分布

3.优选微球支架的30天体外释放测定

4.优选微球支架体外释放30天后残余蛋白的测定

5.微球支架药物释放模型的拟合

三、结果与讨论

1.微球支架的形态学考察结果

2.微球支架的粒径分布

3.优选微球支架的30天体外释放曲线

4.优选微球支架体外释放30天后残余蛋白的测定结果

5.微球支架药物释放模型的拟合结果

四、小结

第四章细胞培养及微球支架上生长实验

一、材料和仪器

1.细胞株

2.试剂

3.仪器

4.磷酸盐缓冲液的配置

5.4％多聚甲醛固定液的配置

二、实验方法

1.细胞培养

2.微球支架上细胞培养

3.细胞生长状态考察

三、结果与讨论

1. NIH 3T3成纤维细胞显微镜下照片

2.经分子探针荧光染色后细胞形态

3.微球支架上细胞生长状态考察

四、小结

五、细胞培养实验中注意事项总结

全文小结

参考文献

致 谢

综述 血管内皮细胞生长因子及其可降解性控释系统研究进展