胚胎肝细胞对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的过程的影响及其机制的研究

摘要

肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织统计，2007年全球肝癌死亡人数已经位居第四。而在我国，2007年城市和农村居民肝癌死亡率均占其恶性肿瘤死因的第2位。以手术为主的综合治疗，是目前治疗终末期肝病，如晚期肝癌及其它肝脏疾病造成的肝脏衰竭等疾病的主要方式。而原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)作为其中最理想的治疗手段，其应用范围受到供肝来源不足、需长期使用免疫抑制剂，以及手术费用高昂等诸多因素的限制。与此同时，肝细胞移植(Liver cell transplantation，LCT)作为整体肝移植的替代手段，因其来源相对丰富，免疫耐受以及相对低廉的费用，受到越来越多的重视。其中具有分化为肝细胞潜能的干/祖细胞，被认为是肝细胞移植的最佳选择。但是干细胞所具有的自我更新和分化潜能的特性，不仅可产生足量的细胞以维持肝脏的功能，同时也具有潜在的危险性。 近年来，随着对微环境的研究的深入，人们发现它在肿瘤发生、发展中起到了重要的作用。干细胞突变为肿瘤干细胞一般被认为是肿瘤发生的起源。而干细胞的微环境更是干细胞维持稳态的关键。通常情况下，干细胞的微环境中的增殖信号与抑制增殖信号处于动态平衡状态。但是当微环境失调，将造成干细胞增殖失控，从而成为许多导致肿瘤发生的基因事件的标靶。因此微环境在肿瘤发生早期起到重要作用。同时，肿瘤的周围也显现出特异性微环境的存在。肿瘤的发生发展同样需要微环境的保护和支持。很多研究都表明，在适宜的微环境中肿瘤更容易快速增殖。因此微环境的因素，也是当前肿瘤研究必需考虑的一方面。 胚胎肝细胞作为肝干/祖细胞的一种，也被认为是肝细胞移植的细胞来源之一。关于胚胎肝细胞的特性，研究人员在啮齿类动物尤其是大鼠身上进行了大量研究。研究所采用的胚胎肝细胞是孕期14天的胎鼠的肝脏细胞，又称为胎肝干/祖细胞(FetalLiver Stem/Progenitor Cells，FLPC/FLSPC)。这一阶段的胚胎肝细胞既表现出肝细胞的特性，又有很强的增殖活性。其增殖活性很可能是由其中占胚胎肝细胞总细胞数的3％的双向潜能的干/祖细胞引起。而快速增殖胚胎肝细胞表现出与临近的受体肝脏细胞的竞争性生长，这种竞争性能引起临近细胞凋亡。我们可以利用胚胎肝细胞来研究肝干细胞移植对受体的影响。 本课题分为两个部分： 一、胚胎肝细胞对大鼠肝癌发生过程的影响 1、不同时期的胚胎肝细胞干预对诱发肝癌的大鼠的生存期的影响。 我们首先通过PCR反应检测Y染色体特异的SRY基因鉴定胚胎肝细胞的性别，建立了性别交叉胚胎肝细胞移植模型，以此对二乙基亚硝胺(DEN)诱导大鼠肝癌发生过程的不同时期进行干预，观察其对生存期的影响。我们发现只有早期干预组的生存期与对照组相比明显缩短，而中期晚期干预组则并无显著差异。 2、大鼠诱导肝癌的早期进行胚胎肝细胞干预对肿瘤生长的影响 然后，我们通过对早期干预组大鼠提前处死，以及缩短其DEN饲喂的时间的方法，研究早期干预对生存期产生的影响，是否由于胚胎肝细胞加快了肿瘤发生的过程造成。我们发现胚胎肝细胞早期干预使DEN诱发肝癌的大鼠的生存期的缩短可能是由于早期的胚胎肝细胞干预促进了肿瘤的发生发展，使DEN诱发大鼠肝癌过程的时间段整体前移造成。 二、胚胎肝细胞促进大鼠肝癌发生的机制的研究 这一部分实验中，我们探讨了这一促进作用产生的机制。首先，我们利用SRY基因作为胚胎肝细胞的标识，用实时定量PCR的相对标准曲线实验，鉴定胚胎肝细胞早期干预组DEN诱发的大鼠肝癌的细胞的来源，发现并无胚胎肝细胞源性的肿瘤发生，胚胎肝细胞更多的是其间接的促进作用，并未直接参与成瘤。接着，我们用血清指标和tunel法对移植的胚胎肝细胞对受体肝脏的影响进行研究，发现它加剧了受体肝脏的损伤。最后我们利用胚胎肝细胞条件培养液，研究发现胚胎肝细胞分泌的细胞因子对肿瘤细胞的增殖有促进作用。 研究结论： 1、胚胎肝细胞DEN诱发大鼠肝癌的过程的早期进行干预，使大鼠的生存期的缩短，这一缩短可能是由于早期的胚胎肝细胞干预促进了肿瘤的发生发展，使DEN诱发大鼠肝癌过程的时间段整体前移造成。 2、胚胎肝细胞本身在这一过程中并未直接成瘤，而是利用加剧受体肝脏损伤以及促进临近的肿瘤细胞生长的双重作用，促进了DEN诱发的大鼠肝癌的发生发展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分胚胎肝细胞对大鼠肝癌发生过程的影响

一、不同时期胚胎肝细胞干预对诱发肝癌的大鼠生存期的影响

(一)实验材料

(二)实验方法

(三)结果

二、大鼠诱导肝癌早期进行胚胎肝细胞干预对肿瘤生长的影响

(一)实验材料(同前)

(二)实验方法

(三)结果

三、讨论

参考文献

第二部分胚胎肝细胞促进大鼠肝癌发生的机制的研究

一、性别交叉胚胎肝细胞移植模型研究DEN诱发的胚胎肝细胞早期干预组大鼠肝癌的细胞来源

(一)实验方法

(二)实验方法

(二)结果

二、移植的胚胎肝细胞对受体肝脏的影响

(一)实验材料

(二)实验方法

(三)结果

三、 胚胎肝细胞条件培养液在体外对肝癌细胞系生长的影响

(一)实验材料

(二)实验方法

(三)结果

四、讨论

参考文献

全文小结

附录

综述 微环境在肿瘤发生发展中的作用

已发表的文章

致 谢