菘蓝中木脂素生源合成途径五个关键酶基因的克隆与功能分析

摘要

菘蓝(Isatis indigotica Fort.)，十字花科二年生草本。其根入药为板蓝根，其叶入药为大青叶，有清热解毒、凉血消斑、利咽止痛的功效，临床用于流行性感冒、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎、急慢性肝炎、带状疱疹等。前期研究表明，落叶松脂素和落叶松脂素苷正是我国传统中药板蓝根发挥抗病毒功效的重要活性物质基础，然而其含量相对较低。到目前为止，菘蓝中木脂素生源合成途径研究很少，该途径上的一些重要的酶基因尚未得到分离。
　　 本研究采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification ofcDNA ends，RACE)技术，首次从菘蓝植物中克隆得到落叶松脂素生源合成途径的五个关键酶基因：肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamic acid4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸∶辅酶A连接酶(4-coumaratecoenzymeA ligase，4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase，CCR)、肉桂醇脱氢酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)、UDP-葡萄糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)的全长cDNA序列和基因组DNA序列。对相关基因进行了蛋白结构的预测和初步的生物信息学分析，对Iiccr进行了原核表达的功能分析。
　　 Iic4h基因：肉桂酸4-羟基化酶(C4H，EC1.14.13.11)属于细胞色素单加氧酶P450超家族，是公共苯丙烷途径中的第二个关键酶，催化反式肉桂酸转变为p-羟基肉桂酸。其全长cDNA为1674 bp(GenBank登录号：GU014562)，包含一个1530 bp的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码509个氨基酸残基。对应的基因组分析表明，Iic4h含两个内含子，三个外显子。在根茎叶各器官中均有表达，其中根中最多。考察了各种刺激因素对Iic4h表达的影响，结果显示紫外照射(Ultraviolet-Bradiation，UV-B)、茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)、脱落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellins，GA3)在一定程度上能够诱导Iiccr的表达上调。
　　 Iiccr基因：肉桂酰辅酶A还原酶(CCR，EC1.2.1.44)是木脂素特异合成途径的第一个关键酶，可催化3种羟基肉桂酸的辅酶A酯的还原成相应的肉桂醛。其cDNA序列全长1368 bp(GenBank登录号：GQ872418)，包含长度为79 bp的5'非编码区(Untranslated Regions，UTR)，263 bp的3'UTR，包含一个完整的1026 bp的ORF，编码341个氨基酸残基。对应的基因组分析表明，Iiccr无内含子。该基因在菘蓝中为组成型表达，且根中的表达最高。考察了各种刺激因素对Iiccr表达的影响，结果显示UV-B、MeJA和GA3在一定程度能够诱导Iiccr的表达上调，而ABA却能够抑制Iiccr的表达。构建其原核表达载体pET-32a(+)，利用大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达其重组蛋白。
　　 Iiugt基因：UDP-葡萄糖基转移酶(UGT，EC2.4.1.91)催化相关的木脂素单体成苷。其全长cDNA为1576 bp(GenBank登录号：GU434222)，包含一个1431 bp的ORF，编码476个氨基酸残基。对应的基因组分析表明，Iigut无内含子。
　　 Ii4cl基因：4-香豆酸∶辅酶A连接酶(4CL，EC6.2.1.12)是苯丙烷代谢途径的最后一个酶，在苯丙烷代谢途径中处于终端位置，催化4-香豆酸生成4-香豆酰辅酶A。其cDNA全长为1967bp(GenBank登录号：GU937875)，包含一个1632 bp的ORF，编码543个氨基酸残基。对应的基因组分析表明，Ii4cl含有五个内含子，六个外显子。
　　 Iicad基因：肉桂醇脱氢酶(CAD，EC1.1.195)催化肉桂醛生成肉桂醇，其cDNA全长为1402 bp(GenBank登录号：GU937874)，包含一个1083 bp的ORF，编码360个氨基酸残基。对应的基因组分析表明，Iicad含有三个内含子，四个内含子。
　　 菘蓝中木脂素生源合成途径五个关键酶基因的克隆与特征分析，为全面阐述菘蓝中木脂素类化合物的代谢流特征，开展植物次生代谢基因工程提高菘蓝中抗病毒活性成分含量打下良好基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章引言

一、菘蓝抗病毒活性物质基础

二、木脂素类化合物研究进展

三、相关酶基因研究进展

四、小结

第二章材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

第三章菘蓝Iic4h的克隆与特征研究

一、Iic4h基因全长cDNA的克隆及其特征分析

二、IiC4H蛋白结构的预测和特征分析

三、Iic4h基因的系统进化树分析

四、Iic4h基因的表达分析

五、Iic4h基因的Southern blot分析

第四章菘蓝Iiccr基因的克隆与特征研究

一、Iiccr基因全长cDNA的克隆及其特征分析

二、IiCCR蛋白结构的预测和特征分析

三、Iiccr基因的系统进化树分析

四、Iiccr基因的表达分析

五、Iiccr基因的Southern blot分析

六、Iiccr基因的原核表达分析

第五章菘蓝Iiugt基因的克隆与特征研究

一、Iiugt基因全长cDNA的克隆及其特征分析

二、IiUGT蛋白结构的预测和特征分析

三、Iiugt基因的系统进化树分析

第六章菘蓝Ii4cl基因的克隆与特征研究

一、Ii4cl基因全长cDNA的克隆及其特征分析

二、Ii4CL蛋白结构的预测和特征分析

三、Ii4cl基因的系统进化树分析

第七章菘蓝Iicad基因的克隆与特征研究

一、Iicad基因全长cDNA的克隆及其特征分析

二、IiCAD蛋白结构的预测和特征分析

三、Iicad基因的系统进化树分析

研究总结

附 录 本文得到的基因的GeneBank登录号

参考文献

硕士在读期间论文投稿及发表情况

致谢