人结石肾内髓集合管细胞的原代培养

摘要

研究背景:尿石症是最常见的泌尿系统良性疾病之一。据研究资料显示，在发达国家中，美国上尿路结石的发病率为13％，加拿大为12％，欧洲为5-9％，日本为10％，其中60％的患者为草酸钙结石。流行病学研究发现男性结石的发病率约为女性的三倍。我国更是世界上尿路结石三大高发区之一。近年来我国泌尿系结石的发病率为1-5％，而南方则高达5-10％，年新发病率120-6020/10万人。不仅如此，结石的复发率也相当高，排石或取石治疗后，7-8年内的复发率约为50-70％。如此高的发病率和复发率使得尿石症成为了一个严重的社会问题。然而结石的发病机制仍然不明，没有有效的手段预防结石的发生和治疗后的复发。目前研究认为结石发生发展主要的可能的影响因素包括环境、代谢及基因等方面。髓质海绵肾是以内髓集合管(IMCD)囊状扩张为特点的一种疾病，并且大部分患者伴有肾多发结石及肾小管酸中毒。内髓集合管(IMCD)作为肾小管的最后一段，位于肾髓质锥体内，IMCD细胞直接参与渗透平衡和酸碱平衡调节。但国内迄今尚未见有人类肾IMCD细胞培养的研究报告。因此，我们尝试进行人结石肾脏IMCD细胞分离、培养。
　　 目的:通过对正常肾脏及肾结石患者肾脏内髓集合管细胞的培养，建立人结石肾内髓集合管细胞的分离、原代培养及鉴定方法，为进一步研究肾结石及海绵肾的发病机制奠定基础。
　　 方法:选取肾癌根治术及肾结石与海绵肾行PCNL手术的患者纳入研究。在术后B超定位下穿刺肾锥体，取出两条目标组织，放入装有无菌生理盐水的冻存管中，并低温迅速运送至实验室。在超净台上，将组织吸出放入培养皿中，吸去多余生理盐水，加入含有胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、DnaseⅠ及抗生素混合的DMEM/F12消化液4ml，将组织剪碎至长度1mm左右后，放入15ml离心管中，室温，持续轻微摇晃消化8小时。消化好的细胞悬液经BDFALCON100um细胞滤网过滤，并研磨未完全消化的组织，使其通过滤网。滤液在室温下400g离心8min，去上清液。用无菌PBS洗涤后，再次在室温下400g离心8min，重复2次。所剩细胞沉淀加入8ml含有10％小牛血清及抗生素的DMEM/F12培养液，分别加入6孔培养板的其中2孔中。同时取3滴细胞悬液加入另一试管，加入0.4％台盼蓝1滴染色3min，以细胞核拒染作为细胞良好的依据。培养板放于37℃、5％CO2环境中静置培养3天，第四天取出，用无菌PBS洗去未贴壁细胞，更换培养液，以后每3天更换一次。于接种后12天加入D-缬氨酸修饰的MEM培养基(含有10％小牛血清及1:50青链霉素)来抑制成纤维细胞的生长。稳定传代后用免疫组化法对上皮细胞角蛋白抗体等进行检测。
　　 结果:消化的时间研究发现，在室温下最合适的消化时间为8小时。正常肾及结石肾IMCD细胞活性良好，培养的细胞形态IMCD细胞相符，免疫组化提示角蛋白18染色阳性。海绵肾的IMCD细胞培养可行。
　　 结论:成功的建立了人类结石肾内髓集合管细胞的培养方法。初步确定了髓质海绵肾的内髓集合管细胞培养可行性。为进一步研究肾结石及髓质海绵肾的发病机制奠定了基础。