蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导非酒精性单纯性脂肪肝小鼠模型建立与益生菌治疗的动态观察

摘要

[研究目的]:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)在我国是高患病率的慢性肝脏疾病，发病率逐年上升。NAFLD的确切发病机制尚不清楚，目前认为是一种与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤。NAFLD疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)以及肝硬化，并最终可进展为肝细胞癌。因此，尽早的对NAFLD进行干预是改善患者预后的重要手段，而目前尚无有充足循证医学证据的药物治疗手段。并且，因其作为金标准的病理学诊断存在创伤，该疾病的目前诊断主要依赖临床诊断，诊断的准确性和敏感性仍有待提高，尤其非酒精性单纯性脂肪肝因其发病隐匿、症状不典型，因而发现较为困难。因此，建立合适的动物模型模型对于研究非酒精性单纯性脂肪肝疾病的规律、改善诊断和治疗手段的意义重大。
　　 [研究方法]:研究分为两个部分。第一部分:1、根据随机分组的原则，24只小鼠随机分入观察组(n=12)和正常对照组(n=12);2、观察组小鼠给予蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCDD)饲养3周，对照组给予正常饮食;3、动态观察小鼠的一般情况，定期称取体重、留取新鲜粪便标本进行四种细菌属的培养（包括大肠杆菌、粪肠球菌、双歧杆菌和乳酸杆菌）;4、分别于第8、15、22d处死小鼠，处死后采集血清标本和肝脏标本;5、鹿清标本用于检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)，并采用酶联免疫法检测肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)以及脂多糖(LPS)水平。第二部分:1、对32只上述2周模型小鼠再次进行随机分组，分为药物治疗组(D组，n=16)和饮食恢复组(B组，n=16)，并按1∶2设立正常对照同周龄小鼠8只（C组，n=8）;2、对药物治疗组小鼠每日两次经胃管给予培菲康治疗，时间共计6周;3、动态观察小鼠的一般情况，定期称重、进行粪便细菌培养;4、于第43天处死小鼠，处死后采集血清标本和肝脏标本;5、所得肝脏标本进行病理学诊断并进行评分量化;6、对所采集血清标本进行ALT、AST、TG、TNF-a、IL-6、LPS检测;7、上述结果进行统计学分析，组内比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验，相关性分析采用Pearson相关性检验，干预治疗效果比较采用单因素方差分析，均以P＜0.05为具有统计学意义。
　　 [结果]:
　　 第一部分:
　　 1、经MCD饮食诱导，小鼠出现精神萎靡、毛发紊乱等现象，病理分析明确从第8d起小鼠肝脏内即出现肝脂肪性变，而8d、15d时间节点小鼠的肝脏病理NAS评分均在3-4分间，与22d（＞5分）、正常对照组（0分）有差异，提示MCD诱导2周即可出现稳定NAFL小鼠模型，并且病变阶段控制在NAFL阶段。
　　 2、MCDD模型小鼠与对照组小鼠相比体重从第4天起下降明显(P=0.02)，并出现毛发紊乱、精神萎靡等一般情况的改变;粪便细菌培养提示了随着MCDD造模时间的延长，模型组小鼠相对正常对照组小鼠逐渐出现了肠道菌群的紊乱。
　　 3、血清中ALT、AST水平随造模时间的延长，均数呈上升趋势，但各时间节点与对照组相比均无显著统计学差异;TG的水平也随时间变化呈现增长趋势，且各时间节点均与正常对照组呈显著统计学差异。
　　 4、血清TNF-a、IL-6、LPS水平造模组小鼠和对照组小鼠在各时间节点均表现出了差异。造模组小鼠血清TNF-a、LPS水平各时间节点均有显著差异，且与造模时间呈明显正相关关系。
　　 5、在P＜0.05的水平，TNF-a、IL-6、LPS、ALT均与病理学评分呈正相关关系，其中TNF-a、IL-6、LPS相关关系极强(r=0.843，0.839，0.884)，ALT与病理评分关系中等(r=0.574);肠道细菌培养的B/E值与病理学评分呈负相关，关系比较强(r=-0.662)。
　　 第二部分:
　　 1、干预治疗组（D组）小鼠一般情况恢复明显优于恢复饮食组（B组），B组死亡率达31.25％，其中三只死亡原因考虑为感染、两只死亡原因不明。体重两组均在3周内恢复至正常，D组稍快，但两组比较无显著统计学差异。
　　 2、D组肠道菌群紊乱恢复明显，第11天B/E值即与正常组无显著差异(P=P=0.02)，且保持相对稳定。仅通过饮食恢复，B组肠道菌群紊乱不能得到纠正。
　　 3、B组小鼠肝脏脂肪性病变仍然明显，且小叶内炎症明显加重;D组小鼠脂肪性病变程度随时间延长有所下降，小叶内炎症几乎未见加重。干预治疗使D组病理表现有所改观，与B组有显著统计学差异(P=0.032)。
　　 4、相关性分析显示代表肠道定植力的B/E值与病理评分在P=0.05水平上呈中等强度的负相关关系(r=-0.526)，而乳酸杆菌与粪肠球菌均与病理评分在P=0.01水平上呈较强强度的负相关关系（r=-0.648，-0.632）。提示了肠道菌群的异常和NAFLD的病变程度之间的相关性。
　　 5、干预治疗后D组小鼠TNF-a、IL-6、LPS水平均与干预治疗前相比有所下降，而B组IL-6水平较前有所下降，TNF-a、LPS水平与干预前相比反而升高，干预对两组TNF-a、IL-6、LPS水平的影响均表现出了显著的统计学差异(P=0.012，0.004，0、026)。而干预后D组小鼠表达水平与同周龄的正常对照组小鼠比较仍有统计学差异(P＜0.05)。
　　 6、干预治疗后B组小鼠ALT、AST、TG水平均与干预治疗前相比略有升高，而D组小鼠均与干预前相比下降明显，干预效果两组表现出了显著的统计学差异(P=0.056,0.013,0、007)。
　　 [结论]:MCD饮食诱导2周可形成稳定的NAFL动物模型，该动物模型出现显著的血脂及炎性因子、内毒素水平升高，升高程度与病变程度关系明显，肝酶关系不明显。NAFLD动物模型存在明确肠道菌群紊乱，补充培菲康干预治疗可有效纠正，仅恢复饮食治疗不能改善。药物干预治疗可改善疾病的发展以及动物的预后情况，改善肝脏病变，有效降低炎性细胞因子及内毒素水平，并表现出肝酶及甘油三酯水平下降。肠道菌群的异常和疾病病变程度相关。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

参考文献

第一部分 MCD饮食诱导NAFL小鼠模型建立及动态观察

一、对象与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第二部分 益生菌治疗NAFL小鼠效果动态观察

一、对象与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

综述

硕士在读期间科研成果

致谢