晚期糖基化终产物修饰的LDL激活肥大细胞脱颗粒的受体途径的研究

摘要

研究背景:糖尿病的心血管并发症已成为糖尿病患者致残和致死的最主要原因。其中低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）经晚期糖基化终产物(Advancedglycation end products，AGEs)修饰后形成的糖基化低密度脂蛋白（Advanced glycationend product modified low density lipoprotein，AGE-LDL）在体内沉积后对促进动脉粥样硬化((Atherosclerosis，AS)的发生与发展起着尤其重要的作用。目前研究表明，肥大细胞(Mast cells，MCs)作为一重要细胞组成成分参与了AS的形成和免疫介导的斑块失稳定进程。然而，AGE-LDL对肥大细胞活性的影响及其相关机制尚未见报道。
　　 研究目的:研究AGE-LDL对小鼠骨髓来源肥大细胞(murine bone marrow derivedmast cells，mBMMCs)脱颗粒活性和toll样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）的表达及其相关信号通路的影响，为糖尿病致AS和急性心血管事件提供新理论。
　　 研究方法:1.取行颈动脉内膜剥脱术患者的颈动脉斑块，甲苯胺蓝染色及激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）观察斑块内MCs和AGEs的分布情况。2.获取雄性、6-8周龄C57BL/6小鼠的骨髓细胞，经含重组鼠白细胞介素-3（Recombinant murine Interleukin-3，rmIL-3）和重组鼠干细胞因子(Recombinant murine Stem cell factor，rmSCF)培养体系诱导骨髓细胞向肥大细胞分化，观察细胞形态，4-6周后收集悬浮细胞，甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测鉴定MCs。3.给予不同浓度的AGE-LDL刺激分化成熟的MCs，分别检测其释放组胺及β-己糖胺酶水平，评价AGE-LDL刺激mBMMCs活化脱颗粒的能力。4.对可能介导AGE-LDL激活肥大细胞的受体的研究:(1)实时定量聚合酶链反应(Real-timequantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)、流式细胞仪和western-blot检测mBMMCs表面TLR4的基因和蛋白表达。(2)检测TLR4基因敲除(TLR4 knockout,TLR4 KO)的MCs经AGE-LDL干预后的组胺及β-己糖胺酶释放水平。5.研究AGE-LDL影响肥大细胞活性可能的信号通路:(1)用AGE-LDL刺激肥大细胞，分别在不同时间点用Western-blot分析核因子κB(Nuclear-κB，NF-κB)、p38 MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化情况。(2)分别用NF-κB、p38、ERK1/2抑制剂PDTC、SB203580、PD98059预孵肥大细胞后，再给予AGE-LDL刺激，观察细胞释放组胺和β-己糖胺酶的情况。
　　 研究结果:1.在人颈动脉斑块标本中观测到肥大细胞浸润及AGEs的沉积。2.经rmIL-3和rmSCF在体外诱导小鼠骨髓细胞4-6周后，甲苯胺蓝染色显示超过99％的细胞被染成蓝紫色，流式细胞仪检测细胞表面分子CD117和FcεRIa表达，双阳性率超过95％，鉴定为成熟的肥大细胞。3.AGE-LDL呈浓度依赖性地激活肥大细胞释放组胺和β-己糖胺酶，在30分钟时达到峰值，与对照组和非糖化低密度脂蛋白(n-LDL)组相比差异均有统计学意义(p＜0.05)，在干预浓度为50ug/ml时作用最强。4.AGE-LDL能够通过上调mBMMCs表面TLR4的表达促进肥大细胞脱颗粒，TLR4敲除后AGE-LDL促肥大细胞脱颗粒的能力显著下降。5.AGE-LDL刺激肥大细胞后能够促进p38MAPK、ERK1/2和NF-κB磷酸化，对JNK磷酸化则无影响;AGE-LDL作用15分钟时NF-κB和p38MAPK磷酸化表达己可升到最高，作用30分钟时ERK1/2磷酸化表达最高。TLR4敲除的肥大细胞NF-κB、p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平不受AGE-LDL影响。p38MAPK、ERK1/2和NF-κB抑制剂SB203580、PD98059和PDTC均能拮抗AGE-LDL对肥大细胞释放组胺和β-己糖胺酶的影响。
　　 研究结论:AGE-LDL能够激活肥大细胞脱颗粒，促进其释放组胺和β-己糖胺酶，该作用由TLR4介导，并与p38MAPK、ERK1/2和NF-κB信号通路的激活相关。AGE-LDL对肥大细胞脱颗粒活性的影响可能是导致糖尿病患者易患AS和易发急性心血管事件的重要病因之一。

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论文说明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 颈动脉斑块中的AGEs与MC及AGE-LDL在体外对mBMMCs脱颗粒功能的影响

材料与方法

结果

讨论

第二部分 TLR4在AGE-LDL诱导mBMMCs脱颗粒中的作用

材料与方法

结果

讨论

第三部分 AGE-LDL介导mBMMCs脱颗粒的机制研究

材料与方法

结果

讨论

论文总结

参考文献

综述

致谢