辐射致小鼠不育症模型的建立及睾丸间质细胞损伤的研究

摘要

目的: 核能和放射线技术越来越多地应用于军事及各个生活生产领域。在现有条件下，辐射对一线战士、放射线环境下的工作人员仍存在一定程度的无法避免的损害效应。性腺对放射线损伤敏感，由此产生的男性不育症成为当今世界日益严峻的社会问题。研究辐射致男性不育症的相关机制，需要经济、遗传信息丰富的不育症动物模型。啮齿类动物模型成本低廉、近交系多、遗传信息丰富，更适用于实验室研究。然而，目前还缺乏理想的辐射致不育症的小鼠模型。辐射导致持久或不可逆的无精症的机制仍不明确。 本研究通过建立了辐射致雄性小鼠不育症的模型、辐射致不育症小鼠生殖系统损伤的检测和分析，提出假设：辐射在导致生精细胞产生损伤的同时，可能也对睾丸间质细胞的细胞功能造成了影响，使血清睾酮水平下降，影响了精子发生的微环境，使精子发生受到阻滞，造成辐射后持久的无精症及不育症。最后，对体外培养的小鼠睾丸间质细胞TM3细胞系的辐射后损伤进行了转录层面、蛋白质层面、细胞生物学行为的分析。本文主要分为以下几个部分: 第一部分60Co-γ射线致雄性小鼠不育症模型的建立 方法：65只7周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为7组：正常对照组（A组，n=5）；12Gy照射组（B组，n=10）；6+6Gy照射组（C组，n=10）；10Gy照射组（D组，n=10）；6+4Gy照射组（E组，n=10）；8Gy照射组（F组，n=10）；4+4Gy照射组（G组，n=10）。观察分析各组小鼠试验后一般情况及死亡情况（观察时间最长为24周）；观察并分析试验后30天、50天、70天，各组小鼠体重、受孕率。 结果：A、E、F、G组生存时间较长，D组生存时间次之，B、C两组生存时间最短。照射后30天、50天、70天，D组和E组受孕率均为0%，而F、G组受孕试验均阳性。各组小鼠各时间点体重与对照组相比明显下降。 结论：用60Co-γ射线照射7周龄的C57BL/6雄性小鼠，双次照射6+4Gy可以构建雄性小鼠的不育症模型；6+4Gy组小鼠生存时间与对照组相比，无明显差异；照射总量为10Gy的情况下，单次照射组比双次照射的生存时间短；12Gy的照射剂量可以导致小鼠在照射后5周内全部死亡；总量≤8Gy的照射剂量，不足以构建雄性小鼠不育症模型；辐射对小鼠的体重有影响。 第二部分60Co-γ射线致雄性小鼠不育症模型的损伤分析 方法：216只7周龄的雄性C57BL/6小鼠完全随机分为4组：正常对照组（A组，n=54）；6+4Gy照射组（B组，n=54）；4+4Gy照射组（C组，n=54）；6Gy照射组（D组，n=54）。第30天、50天、70天，对睾丸指数进行分析；对睾丸石蜡切片HE染色进行观察和精子发生评估；对PLZF阳性标记的精原干细胞（免疫组化法）进行计数；对血清inhibin B、睾酮、FSH水平进行测定（ELISA法）；对睾丸间质细胞标志物3β-HSD蛋白水平进行检测（Western Blot法）。 结果：照射组小鼠的睾丸指数均低于对照组。各照射组睾丸组织Johnsen评分与对照组相比均下降，呈照射剂量-效应关系。B组在第30天、50天、70天，PLZF阳性细胞计数明显低于对照组水平，余组在部分时间点差异不明显。第30天、50、70天，B组血清inhibin B水平低于与对照组，其余照射组与对照组相比无统计学差异。第30天、50天，C组与D组血清FSH水平比对照组高，B组无显著差异；第70天，C组的血清FSH水平比对照组高，余组无显著差异。第30天、50天、70天，各照射组血清睾酮水平比对照组明显下降。第30天，各照射组3β-HSD表达下降，呈照射剂量-效应关系。第50天、70天，各照射组的3β-HSD表达水平与对照组相比没有明显差异。 结论：辐射导致小鼠睾丸指数下降、精子发生功能损伤，呈剂量-效应关系。其中，6+4Gy照射后，小鼠睾丸中精原干细胞仍存在并维持增殖，但精子发生出现阻滞，表现为无精症、不育症。因此，6+4Gy的γ射线的照射可以成功构建雄性小鼠不育症模型。各照射组的睾酮水平均下降，提示睾酮可能是导致精子发生阻滞的微环境因素之一。血清inhibin B水平可以提示不育症模型组小鼠的生殖功能的损伤。睾丸组织3β-HSD蛋白水平可以提示照射较早期睾丸损伤的程度。 第三部分60Co-γ射线致睾丸间质细胞TM3损伤的研究 方法：hCG刺激试验：TM3细胞铺12孔板，加药组hCG浓度为1IU/ml、10IU/ml，对照组不加hCG。在细胞培养24、48、72小时取细胞培养基上清液检测睾酮值。TM3细胞辐射损伤试验：TM3细胞铺板后分组进行60Co-γ射线照射，剂量分别为：3Gy、6Gy、9Gy，对照组不辐照。于试验第24h、48h、72h观察各组细胞凋亡情况（流式细胞法）、氧化损伤（ELISA）、睾酮分泌（ELISA）、睾酮合成关键因子（StAR、P450scc、P450c17和3β-HSD）的转录水平（qPCR法）。试验第24、48、72、96、120、144小时，观察细胞增殖情况（MTS法）。 结果：hCG刺激试验中，细胞培养48h，添加hCG细胞组的睾酮浓度明显高于对照组；72小时，添加1IU/mlhCG细胞组的睾酮浓度明显高于对照组。细胞凋亡实验表明，第24小时，3Gy和6Gy组的早期凋亡细胞百分比上升；第48小时后，在6Gy和9Gy组的上升；第72小时，各照射组的均上升。第24小时，仅9Gy组晚期凋亡细胞百分比上升；第48小时后，仅6Gy组的上升；第72小时，6Gy及9Gy组的上升。细胞增殖实验中，72小时开始，6Gy及9Gy组OD490值低于对照组，144～120小时，各照射组OD490值均低于对照组。氧化损伤实验中，3Gy组8-OHdG与对照组相比无差异；6Gy组8-OHdG浓度在第72小时高于对照组；9Gy组8-OHdG浓度在第24小时、48小时、72小时均显著高于对照组。在重复3次的睾酮水平检测中，对照组均可测出睾酮浓度；而照射组中，仅9Gy组在第24小时可测得睾酮浓度，高于对照组，9Gy组余时间点及余照射组中测得的值因低于ELISA试剂盒可测范围，无法测出3次睾酮浓度。各组相对StAR、P450scc、3β-HSD转录水平在第72小时均低于对照组；第72小时，3Gy组的P450c17转录水平与对照组相比，6Gy组转录水平高于对照组，而9Gy水平低于对照组。 结论：3Gy的60Co-γ射线就能诱导TM3细胞的细胞凋亡、抑制细胞增殖；≥6Gy的辐照还能引起明显的氧化损伤；9Gy的辐射对4种睾酮关键合成因子（StAR、P450scc、P450c17及3β-HSD）的转录均有明显抑制作用。 创新点与小结 首先，成功地制备了不育症持续时间长、死亡率低的辐射致雄性小鼠不育症模型，为辐射导致男性不育症的机制研究提供了实验工具。其次，通过Johnsen评分、PLZF阳性精原干细胞计数的分析，发现不育症小鼠维持较长时间症状的原因是精子发生的阻滞，而不是精原干细胞的缺失；导致精子发生恢复阻滞的原因不是精原干细胞功能异常，而是精子发生的微环境受到了损伤。第三，通过体外实验，发现在较低照射剂量（3Gy）的辐照下，睾丸间质细胞增殖和生物功能均受到影响，提示精子发生阻滞的原因之一可能是睾丸间质细胞受损后使睾酮合成和分泌下降，从而改变了精子发生的微环境，精原细胞进一步分化成熟发生了障碍，导致了无精症的发生。 以往研究者们对小鼠辐射后精子发生恢复是否存在阻滞现象；精子发生阻滞的原因是精原干细胞缺失，还是精子发生的微环境改变；睾丸间质细胞是否能耐受低-中剂量的辐射等一系列问题，均存在争议。我们的研究从新的视角对这些问题进行了观察分析，为研究辐射导致男性不育症的机制研究打下基础，提供了实验数据。

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